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1、微型月季组培苗辐射诱导植株变异研究周钦佩，陆锋，江夏伟安徽农业大学园艺学院 230036摘要：对微型月季组培苗辐射处理，有望利用组培和辐射的优势对微型月季从花苞、花型、株高、花香等观赏特性方面进行改良。本项目拟利用 Co60 射线对微型月季组培苗和扦插苗进行处理，通过对处理苗的常规培养，观察处理苗与对照苗生长状况的不同，从而筛选出优良变异植株。关键词：微型月季，组织培养，辐射，变异引言微型月季是由中国小月季、多花月季以及小姐妹型月季杂交育成的，微型月季植株高一般不超过30cm。较其他类群现代月季而言，微型月季具有具有株型小，花形紧凑、耐寒能力强、开花时间长等特点，是一类很有发展潜力的室居装饰花
2、卉。另外，在现代园林设计中，花期长、小巧玲珑，花形精美的微型花卉也越来越受到重视。微型月季作为一种微型花卉资源在市场开发中有着较好的前景，它可以用于地皮绿化、花坛和花篱构建的材料，还可成设于花架、布置于假山之上等，近年来发展很快。微型月季在国内外的颇有发展，目前国外的微型月季的研究已经有一定的深度。我国微型月季起步较晚，优良品种基本由国外进口，价格昂贵。利用种子繁殖可应用于育种，但微型月季花型小，结实率低（一般每个蔷薇果只有12粒种子） ，创造新品种几率低，且耗时过长。诱变育种由于方法简便、安全、经济，突变率较高（突变率一般可达到千分之几，有时可以达1/30，比自然突变率高1001000倍，可
3、引起植物形态结构和生理生化多方面的变异，而且产生的变异有的稳定很快，可在较短时间内育种新品种） ，更适合人们培育园林植物求新求异的特点，因此辐射诱变是目前园林植物品种培育与改良中的一种非常有效的手段。本项目通过利用Co60射线对微型月季组培苗和扦插苗进行辐射处理，希望得到优良变异，通过对处理苗的常规培养和试管开花诱导，观察处理苗与对照苗生长状况的不同，从而筛选出优良变异植株。1、试验材料与方法Co60辐射处理微型月季组织培养 盆栽苗扦插变异筛选微型月季愈伤组织诱导盆栽微型月季苗 1.1 材料市售微型月季苗，琼脂，营养基质等1.2 方法1.2.1 组织培养选用优质材料经消毒（见下表4第4组合）
4、、无菌接种进行初代培养，所用培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。以继代培养基MS+6-BA1.0 mg/L +KT0.5 mg/L +NAA0.5 mg/L进行继代培养。继而进行增殖培养，增殖培养中用到正交试验方法，具体组合见下表1。通过对照比较，筛选适宜增殖的培养基，对组培苗继续进行增值培养。另外，取优质微型月季叶片、茎段进行愈伤组织诱导。1.2.2 盆栽苗扦插选取优质盆栽微型月季苗，剪成含一到两个茎节约5-6cm的茎段，在经消毒过的基质中进行扦插，每两到三天浇一次水，以保证茎段切口湿润，从而使其生根良好。1.2.3 Co60射线辐射取生长良好的愈伤组织和长势良好的扦插苗
5、分三组进行辐射，具体剂量如下：表1：辐射处理组合组别 1 2 3处理（Gy） 25 30 352、试验结果与分析2.1具体实验进程及观察结果2009年6月底开始着手进行试验，首次选用优质材料经消毒（见下表3第4组合）进行初代培养，所用培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。一周后，转接进行继代培养，所用培养基为MS+6-BA1.0 mg/L +KT0.5 mg/L +NAA0.5 mg/L。经过56天的继代培养，组培苗平均高度达到4cm，且均生有嫩芽，并有两株在三角瓶内已成花，但多数已表现出一定的缺养，处于饥饿状态。9月7日，进行了第二次转接，进行增殖培养。由于希望在微型月季组
6、培苗增殖培养过程中观察到不同的生长现象，研究不同激素对组培苗生长、生根及新生芽发生的影响，我们运用正交设计设置了6-BA（0.5、1.0、1.5 单位mg/L ，下同） 、NAA（0.05、0.10、0.15） 、KT（0.4 、0.5 、0.6） 、IBA（0.05、0.10、0.15）四个激素的不同浓度组合，以期筛选出最佳的增殖培养方案。组合如下：表2：四种激素正交组合组别 6-BA NAA KT IBA 1 0.5 0.05 0.4 0.052 0.5 0.1 0.5 0.13 0.5 0.15 0.6 0.154 1.0 0.05 0.5 0.155 1.0 0.1 0.6 0.056
7、 1.0 0.15 0.4 0.17 1.5 0.05 0.6 0.18 1.5 0.1 0.4 0.159 1.5 0.15 0.5 0.05对以上各组实验的观察记录如下:表3：对9个试验组合的观察观察日期组别生长状况2009-10-12 2009-10-19 2009-10-27 2009-11-10 2009-11-191均有不同程度的黄化，长势较差，仅两瓶长势稍好，无新生芽均发生黄化，9瓶接近死亡，7瓶出现生长，株高 1cm，无新生芽8 瓶接近全部死亡，8 瓶出现生长 1-1.2cm，黄叶相对减少（脱落） ，几无新生芽除个别绿株外，全部死亡，几无新生芽2黄化同上，长势较差，无新生芽黄化
8、严重，大量死亡，基本无绿苗黄叶很严重，仅个别绿株且无明显生长，株高 0.5cm6 瓶绿株，无明显生长，其余全部死亡36 瓶黄化，整体生活较好，但无明显生长，个别新生芽均有不同程度黄化，无明显生长，个别新生芽黄苗减少（脱落） ，0.5-0.8cm，均有生根，2cm 左右黄化较严重，株高0.5-1.5cm 不等，几无新生芽，普遍生根，3-4cm42 瓶黄化，整体生活较好，但无明显生长，个别新生芽，其中 8 瓶生根，0.5cm2 瓶黄化，生长良好，无明显生长，个别新生芽，部分根长 0.8cm10 瓶生长良好，1cm，生根不齐 0-0.5cm/2-3cm，新生芽增多均有不同程度黄化，4 瓶生长良好，也
9、嫩绿，0.5-1cm，其余 0.5-0.8cm，普遍生根 3-4cm，新生芽增多56 瓶黄化，长势较差，仅 3 瓶生活较好黄化严重，无明显生长，部分死亡黄化严重，株高0.5cm，个别新生芽黄化严重，个别绿株，0.5cm 左右，个别生根 0.5cm66 瓶黄化，长势较差，2 瓶生活较好大部分黄化，生长不明显9 瓶黄化较严重，其余无黄叶，绿株株高 0.5-1cm 不等，2 瓶生根达 3cm，大部分死亡，个别绿株，0.5cm，个别生根 0.5cm 左右，个别新生芽各组较之前的观察无明显生长，黄化更严重，死株增多，植株出现缺养现象，处于饥饿状态其余的未生根76 瓶黄化，其余生长良好，无明显长高2 瓶稍
10、有黄化，生长良好，1cm生长良好，黄叶转绿，株高 0.8cm-1.2cm黄化较重，植株低矮，无生根，无新生芽87 瓶黄化，生活较好，老叶较多，叶片较其他组明显大，较少新生芽3 瓶稍有黄化，个别生长良好，1cm，其余的也稍有生长现象，新生芽增多生长较好，0.5-1cm，3 瓶株高达1.5cm黄化较重，大部分无明显生长 0.5cm左右，个别 1.5-2cm,叶片较大，个别生根 1cm 左右93 瓶黄化，其余同上同上 出现少许黄叶，0.5cm黄化严重，低矮，0.2-0.5cm，个别1.5cm，个别生根，1cm，叶片较大正交实验结果：MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.05 mg/L +KT0
11、.5 mg/L +IBA0.15 mg/L、MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.15 mg/L +KT0.6 mg/L +IBA0.15 mg/L、和 MS +6-BA1.5 mg/L + NAA0.05 mg/L +KT0.6 mg/L +IBA0.1 mg/L这三个配方适宜植株生长，其他的配方组合不宜于植株生长。可能由于试验操作不规范或培养室温度过高导致植株发黄，甚至部分植株死亡。对于各组内生长不齐的现象，其原因可能是接入的材料生长状况的同，或是培养基没有混合均匀。以上各组均在初期就出现黄叶，原因可能有以下两个方面：接种时，解剖刀和镊子在酒精灯上烤的过热，且没有冷凉就去接种；培养室
12、温度过高。对于各组内生长不齐的现象，其原因可能是接入的材料生长状况的不同，或是培养基没有混合均匀。2009年11月19日，将材料重新转接入生根培养基和增殖培养基，其中以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+KT0.5mg/L+IBA0.15mg/L配方配制生根培养基，增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，最后接种得生根苗38瓶，增殖苗40瓶，共78瓶。2009年11月24日观察时，78瓶组培苗绝大多数都已污染。2009年11月28日，将上述78瓶中生活的苗子取出重新进行消毒处理，并转接入增殖培养基，共转得60瓶。因为组培苗已生有内生
13、菌，所以新转接的苗子又很快出现了污染。2010年1月8日，以微型月季嫩叶、新生芽和嫩茎消毒（见下表3）接种共得119瓶，进行初代培养。经7天观察，有1瓶叶片污染，6瓶嫩茎污染，新生芽培养无污染。分四组对材料进行消毒，如下：表4：消毒处理组合1 2 3 4酒精 20s 20s 30s 30s升汞 8min 10min 8min 10min（经观察，四组无明显区别）2010年1月18日，将以上初代培养材料转入继代培养基（MS +6-BA1.0+KT0.5+NAA0.5）继续培养（诱导愈伤组织） ，共得136瓶。至2010年3月2日，以上试验中28瓶叶片污染，87瓶嫩茎及幼芽污染，无污染的叶片边缘生
14、有少量愈伤组织，嫩茎和幼芽未出现生长，但周围生出团状愈伤组织。2010年3月5日，对以上愈伤组织进行转接，转入增殖培养基（MS+6-BA1.5+NAA0.2）进行愈伤组织增殖培养，共得34瓶。经一周的观察，增殖培养的愈伤组织无污染。2010年3月10日，取盆栽微型月季茎进行扦插。2010年4月10日，对已变绿的增殖培养的愈伤组织和已生根的扦插苗进行辐照处理。如上表1至5月6日，辐射的愈伤组织全部干死，扦插苗发黄死亡，无法继续后继试验。2.2 结果与分析2.2.1 组织培养组织培养过程完成了预期目标，培养出了健康优质的组培苗，为后续工作筛选适宜增殖培养基配方做了良好的铺垫。而且，最终筛选出了较适
15、宜微型月季增殖的三个培养基配方：MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.05 mg/L +KT0.5 mg/L +IBA0.15 mg/L、MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.15 mg/L +KT0.6 mg/L +IBA0.15 mg/L、和MS +6-BA1.5 mg/L + NAA0.05 mg/L +KT0.6 mg/L +IBA0.1 mg/L。不足之处是，组培过程中出现多次污染，可能是实验过程中操作的不完全规范，特别是无菌操作过程中消毒不彻底，防护不严密等缘故。2.2.2 盆栽苗扦插微型月季扦插进行得十分顺利，利用盆栽苗进行的扦插，经过三周的精细管理，即生出一厘米长的
16、乳白色根，且有新芽生出，生长健壮。由此可知，微型月季极易扦插成活，适宜扦插繁殖。2.2.3 辐射处理此过程最终失败，辐射过的愈伤组织全部干死，扦插苗发黄死亡。这可能是辐射剂量过大，达到致死剂量，或是后期管理不当，使得愈伤组织和扦插苗全部死亡。3、结论与讨论3.1 结论本项目试验虽然前期进展较顺利，但后期辐射的愈伤组织和扦插苗全部死亡，试验无法继续进行，试验没能王成预期目标。3.2 讨论经过近一年的试验，期间进行了微型月季组培苗增殖培养，微型月季愈伤组织诱导及其增值，对微型月季组培苗及愈伤组织进行辐射处理，微型月季苗扦插等试验。查阅了大量关于微型月季初继代培养、辐射育种的相关文献、期刊。实际进行了培养基的配制、灭菌，材料的消毒、无菌接种，培养材料的初代、继代培养等操作。通过试验，了解到月季苗组培较易，且极易扦插成活。但可能由于实验过程中操作的不完全规范，特别是无菌操作过程中消毒不彻底，防护不严密等，导致出现多次污染，使各阶段试验进展不顺，最终导致本次试验未能得到预期结果。本次试验虽未取得成功，但从失败中我们同样学会了
