重组鱼类促生长因子蛋白在水产养殖应用进展-畜牧渔业论文重组鱼类促生长因子蛋白在水产养殖应用进展 钟鸿干1，姜巨峰2 （1.三亚市海洋与渔业监测中心，海南 三亚 572000；2.天津市水产研究所，天津 300221） 摘要：鱼类的生长主要靠生长激素/胰岛素样生长因子轴（growth hormone/insulin-like growth factors，GH/IGFs）所调控，而生长激素（Growth hormone，GH）和类胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）是GH/IGFs中两种最重要生长调控因子体外重组表达的GH和IGF-Ⅰ蛋白都具有增强食欲、提高饲料转化率，加速鱼体生长的活性，可以作为高效生物饲料添加剂，在水产养殖具有广泛的适用性本文从重组表达鱼类促生长因子蛋白研制的必要性、作用机理、表达情况以及在水产养殖应用情况方面进行总结，以期为重组表达鱼类促生长因子蛋白的工厂化制备提供参考 关键词：重组蛋白；鱼类促生长因子；水产养殖；应用 1重组鱼类促生长因子蛋白研制的必要性 鱼类的生长速度是养殖户所关心的主要问题，其生长的快慢严重影响了养殖效益。
一些养殖户为了牟谋取更多的利益，经常滥用抗生素类、激素类等非营养性药物添加剂来促进鱼类生长和提高饲料利用率，而带给社会的是严重的水产品质量安全问题 2002年3月5日，农业部发布了“食品动物禁用的兽药及其它化合物清单”，对一些常用的促生长添加剂进行了禁用，这从一定程度上影响了一些水产养殖户的利益而相应的在使用效果和经济上能够替代非营养性药物添加剂的绿色无公害促生长产品一直不能问世，导致在养殖生产过程中经常会出现养殖对象生长缓慢或者停滞生长的现象、造成养殖成本居高不下，而养殖对象的价格又偏低，利润空间较少，极大地挫伤了养殖户的积极性，严重地阻碍了水产养殖业的健康发展另一方面，一些不法份子铤而走险，继续违法使用非营养性药物添加剂，对水产品质量安全造成了严重隐患，直接危害了公共卫生安全；同时也影响到了中国水产品的出口因此开发一种绿色无公害的促生长制剂是当前一项重要的工作 鱼类的生长受多种激素调节，其中GH/IGFs在鱼类生长的调节中起着最为重要的作用，而GH和IGF-Ⅰ是GH/IGFs中两种最重要的生长调节因子，因此，GH和IGF-Ⅰ在水产养殖领域具有重要的应用价值而基因工程技术和现代发酵技术实现了重组鱼类GH体外高效表达生产且安全无毒性作用，可添加于饲料中，是提高我国水产养殖产量的最佳途径，属新一代高效鱼促长饲料添加剂。
大量实验证实，体外重组表达的GH和IGF-Ⅰ蛋白都具有增强食欲、提高饲料转化率，加速鱼体生长的活性，可以作为高效生物饲料添加剂，在水产养殖具有广泛的适用性 2重组鱼类促生长因子蛋白的作用机理 采用注射、投喂和浸泡等方法均可将具有生物活性的重组生长因子蛋白引入鱼体，鱼类胃和后肠上皮细胞可通过泡饮作用吸收完整的促生长因子蛋白，具有生物活性的生长因子可以进入鱼体血液中进行循环，与血液中的GH结合蛋白或IGF-I结合蛋白结合后，被运送到周边组织发挥作用，进而促进鱼体的生长 3重组鱼类生长因子蛋白的表达研究 有关重组鱼类生长因子表达的报道较多，无论是选用大肠杆菌(郝羽等，2011；白俊杰等,1999)、酵母(黄晓南等，2011；谢帝芝等，2011；王伟等,2003；陈荣忠等，2003)还是藻类(Kawata et al,1991)、昆虫细胞(Tsai et al,1994)、拟南芥(肖生科等,2004)、病毒（孙颖等，2006）作为表达的宿主均有成功的实例但是由于大肠杆菌和酵母表达系统的遗传背景清楚、繁殖速度快、表达量高、成本低，同时它们也是目前研究最成熟的表达体系，绝大多数研究者选用大肠杆菌和酵母作为重组蛋白表达的宿主菌。
谢帝芝等（2011）在毕赤酵母中表达了青鱼（Mylopharyngodon piceus）生长激素，在pH值6.5、0.5% 甲醇、温度30 ℃和培养时间72 h的优化条件下，重组青鱼生长激素蛋白的表达量高达893 mg/L黄晓南（2011）用酵母表达系统发酵结束后，菌体湿菌达到320 g/L，发酵液上清中可溶性蛋白总量达到415 mg/L经SDS—PAGE电泳验证产物为该大黄鱼（Pseudosciaena crocea）生长激素高春生等（2008）对淇河鲫（Carassius auratus）生长激素，经终浓度0.1 mmol/L IPTG诱导后成功地表达出重组生长激素蛋白王伟等(2003)将草鱼（Ctenopharyngodon idellus）生长激素在毕赤酵母中高效分泌表达量的50 mg/L陈荣忠等（2003）对鲈鱼（Lateolabrax japonicus）GH高效表达酵母工程菌时，用廉价的工业无机盐培养基进行高密度发酵，每升培养液的成本降低到1.50元左右，其生长最终OD600可达60～100，并在此基础上确定了发酵的最适条件(pH、温度、溶解氧、搅拌速度等)，rFGH表达量达到每升发酵液0.6 g。
郝羽等（2011）利用大肠杆菌表达系统表达了军曹鱼（Rachycentron canadum）生长激素基因，发现在诱导温度为37 ℃，IPTG的浓度为1 mmol/L时，诱导4 h后，GH融合蛋白表达量达到最高华益民等（2001）利用大肠杆菌表达系统表达了草鱼IGF-I基因，诱导温度为37 ℃，IPTG的浓度为0.5 mmol/L时，诱导3～5 h后，GH融合蛋白表达量占菌体总蛋白的21.4%左右 4重组鱼类生长因子蛋白促生长效果研究 重组鱼类生长因子蛋白主要包括重组IGF-I蛋白和重组GH蛋白，许多学者都对其促生长效果进行了研究，均发现其有显著的促生长作用 4.1重组鱼类IGF-I蛋白促生长应用情况 黄燕琴等（2007）将鲮（Cirrhina molitorella）IGF-Ⅰ重组蛋白纯化、复性后，按0.5和1.5 μg/（g鱼体重）腹腔注射罗非鱼稚鱼，经6周处理后，与对照相比，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的净增重率分别为53 %和67.3 %，表明了重组mcIGF-Ⅰ具有显著的促罗非鱼生长作用Emmanuel等（2005）克隆了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）IGF-ⅠcDNA，并研究了IGF-Ⅰ水平与罗非鱼生长速度的关系，结果标明，对于生长速度较快的罗非鱼，IGF-ⅠmRNA在肝脏中表达量也较高。
Anthony R. vyer等（2004）就尖吻鲈（Lates niloticus）的生长速度与IGF-Ⅰ含量进行了研究，结果证实了IGF-Ⅰ可以用来作为检测生长速度的一个指标Jyh-Yih Chen等（2000）用重组IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ腹腔注射罗非鱼发现以2 μg/g体重IGF-Ⅰ和2 μg/g体重IGF-Ⅱ的剂量注射5周后，实验组和对照组有显著差异，体重分别增加73 %和72 %，体长分别增加33 %和34 %，而且发现这种促生长作用具有剂量依赖效应Mccomick等（1992）发现重组猪IGF-Ⅰ能提高银大麻哈鱼（Oncorhynchus keta）的生长率和软骨对硫的吸收率另外，有关斑点鮰(Ictalurus punctatus)（Peterson et al.，2004）、虹鳟（Oncorh ynchus mykiss）（Castillo et al.，2004）等其它鱼类（Shunsuke et al.，2002）IGF-Ⅰ的促生长活性也有报道 4.2重组鱼类GH蛋白促生长应用情况 黄晓南等（2011）利用构建的高效表达的大黄鱼生长激素酵母工程菌，制成促生长饲料，对大黄鱼和眼斑拟石首鱼（Sciaenops ocellatus）2种海水经济鱼类进行生长状况对比，经过45 d的喂养试验后，幼年大黄鱼平均增重率提高27.9%，眼斑拟石首鱼平均增重率提高51.0%。
孙颖等（2006）应用重组草鱼生长激素对草鱼鱼种进行投喂，发现试验组的生长速度显著高于对照组Peter 等（2004）利用重组牛GH注射斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），通过每三周注射一次重组牛GH，剂量分别为30、60和120 μg/g鱼体重，经过9周的实验，结果发现，与对照组相比，注射剂量为120 ug/(g鱼体重)的鱼体重增加最多，证实了GH的促生长活性并与剂量有关； Yuk Hang Chan等（2003）在大肠杆菌中表达了金鱼GH，也证实其具有促生长活性；陈荣忠等（2003）成功构建了高效表达的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）生长激素甲醇毕赤青鱼生长激素基因酵母工程菌，并将该酵母作为饲料添加剂分别饲喂花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus)、卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)、大黄鱼，增重比率均值分别为20.0%、17.3%、l8.4% 和56.8%马进等(2001)在饲料中分别加入质量分数为2% 含虹鳟GH的酵母菌和不含GH的酵母菌，为期7周的饲养后，实验组体长和体重增长率分别比对照组快22.9%和38%重组大黄鱼PcGH对大黄鱼和眼斑拟石首鱼均表现明显的促生长作用，经过45 d的喂养试验后，幼年大黄鱼平均增重率提高27.9%，眼斑拟石首鱼平均增重率提高51.0%。
白俊杰等（1998）在大肠杆菌和酵母中分别表达了鲑鱼（Salmo salar）GH，并证明了其具有促罗非鱼生长活性，并且这种促生长作用具有剂量依赖效应；Tsai等（1993）在酵母中表达了虹鳟GH，将重组酵母菌与饲料混合投喂罗非鱼幼鱼，实验组鱼体重增长比对照组快35.5%；Agellon等（1988）将重组GH处理虹鳟幼鱼，实验结束时，实验组比对照组生长快50%另外，有关虹鳟（Oncorhynchus miss）(Takagi，et al.，1992)、草鱼（Li，Y.H，et al.，2003）等鱼类的重组GH的促生长活性也进行了研究 5小结与展望 随着生物技术的发展，鱼类的GH和IGF-Ⅰ的研究得到了快速的发展通过GH和IGF-Ⅰ基因的转移，促使鱼体内GH和IGF-Ⅰ的大量生产，提高了鱼的生长速度同时，利用大肠杆菌和酵母表达了鱼类GH和IGF-Ⅰ，提高了GH和IGF-Ⅰ的产量，降低了生产成本且安全无毒性作用，可添加于饲料中，是提高我国水产养殖产量的最佳途径，属新一代高效鱼促长饲料添加剂，大量实验证实，体外重组表达的GH和IGF-Ⅰ蛋白都具有增强食欲、提高饲料转化率，加速鱼体生长的活性，在水产养殖具有广泛的适用性。
这为重组表达的鱼类促生长因子工厂化研制提供了参考依据 实现这一目标一是要构建高效表达鱼类生长因子的大肠杆菌工程菌和酵母工程菌；二是要通过中试试验解决一些生产技术关键问题.比如发酵培养基配方、发酵条件的各项参数、发酵产物的后处理、作为饲料添加剂的配比、产品质量的控制等技术，为大规模生产创造必要条件 参考文献：(略） 。