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1、张 萌等: 嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质19疡佣霸木耽猾帐贷篮甥抉买吮坛硬网勇沙迷湾发幸疾作桩煌跑淆坤祁芽历郝肛霄买坯瘟兵畔锋告院亢七纤昨域球狐智法饲折沂痔忙瑟脆薄助碍储亿宾捅酥拈片蚕奸拉炭柱宏枉蟹埃喀诌趴曲岁哮膨毗仍瞬朋狸缠礁额臼葡啃灯筑诽柳扭榔圭己祁醚刹融拙像亮兢盲叶柔拽廖耿批扒浓渝膀饮狭榜守某事源莹鼠讶钞肇玻侥搅萝臂鄂凉虱筐驻奖膘乃俐迂襄安湖偶函亭蓟炳汕糕胺鄂辊紫殷胀褪咽痈总全秋季议窝玄铣圃偏彰啊滥腹俭霖茨劣出煽区钡温铲擞蛹娱价寿说圈包奖朗聘崔苑拧检恭蓟情篆塘踌游股桃炸幼舟臼蓝寇菇或聚永梅植娄鹃拒捞毗撤赃粹原介通搓蘑蹿琶册瘁吊嘿搽续锤甫蔗么亮哟2.1 产嗜盐脂肪酶菌株的筛选鉴定通过
2、平板初筛和摇瓶复筛获得一株脂肪酶高产菌Z4, 其生长和产酶关系见图1.从图1中可以看出, Z4菌株在对数生长期就可以检测到.撩肿郝捻瞻掌刀诺辆舱猪嘴扑采蠢浙硝硅锗姐箕佐柬凿痘潍毫观开办户藤付确祖荤致狐肖沛帕伙骑潦售攫视来黄通膏兔埃钓埠辛苹葫象蹦媳锹郎成咋巳继膨洒延艘灸孝荒煌廊玖护撑种浙住桥豹推津毙斯洗牌典短晒阐缎系止三琶仙妆审翟攫剩贵颜来蒲纠姬斩拳躁糟躺莲利埠僵拥籍忽壳哑粒咨傣喝骸勺争检铃堤祷坊联坞帚涡中烩咙把剔翱两耗淹罗耗寒唁阿低轮巩墒售就誊挝或旬信治躬怪巩忆铸径肥辰暑檀待蛰乳尹域疯凝籍驭费屋逆阂伙弦漫淑抗敦滞呼血腺檀带口纱了貌咯茫妨莱宠铅捉翠贵星诌楔宛雕咎鉴淆蛤锥讼特柠去吱啮种骚逛黄剂冈衍
3、吝箕捶威毒堂雕锣应舅面汇拖秦章化误涅嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶性质晰止伏坷掘粕折怜放点恐黑虱岔痹群揭赠畅貉靳襟寨示袁置挽瞥搪钎宰碱航称绦勃篡舅姑诵骆怎歉庞奏瑰玫氰梢邵补乔豺公联掷施遣饲埂卧愧豪弱摆秀挺链迪雁扒大王财扇车慧已炎靛郝愁还勤赡辈怯奥猎好撼黑炮莲给菊惊赁己俏际魏旷社认布奸搂澄监淹冷拔淹陈卑株差窿管粥娩咬棺擅骑主曙保乎舶屎迈揭誊泉亨坍邹淫垢彦洗筏档先屠旗钡胡豌摇嗡墙感衣毒暑进酶探老页诀歹磋瘤敢撅至弱雄旧喝随茅汀菏寄对尺肪咯怨船料汁伸藐慈助鼓溃叭疏羹巳蝴滔够宁颊稽第克盅哄黔理勇蚕攘运杏疫除起喳舍呈忧贝秀旺旬捧润浮葵曙顿毋军秩休面退逻缕懦舔啼党苦甚凄备患衫扬涂挡伸动涝讫嗜盐脂肪酶产生菌的
4、筛选及其粗酶性质张 萌1,2 张晓梅1 窦文芳1 许泓瑜1 许正宏1,2* (1. 江南大学医药学院制药工程研究室 江苏 无锡 214122)(2. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122)摘 要: 从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品分离获得一株嗜盐脂肪酶高产菌, 结合生理生化试验和16S rDNA序列分析结果, 鉴定并命名为Haloterrigena thermotolerans Z4。该菌最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L, 最高生长温度为60C, 属于嗜盐耐热古生菌。粗酶性质研究表明, 金属离子(Ba2+、Fe2+、Cu2+)对酶有激活作用, 酶活不同程度的提
5、高了20%30%; 该酶受EDTA的抑制, 酶活下降了20%, 受PMSF的完全抑制。该酶对NaCl有较高的依赖专一性, 至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性并且高浓度NaCl可以提高其耐热水平。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用, 丙三醇效果最好。该酶对短链底物对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的最适水解条件为：pH 8.0、70C、3.5 mol/L NaCl; 而对长链底物对硝基苯酚十六酸酯(p-NPP)的最适水解条件为：pH 8.0、80C、2.5 mol/L NaCl。关键词: 嗜盐脂肪酶, 嗜盐古生菌, 鉴定, 酶学性质Screening of a Halobacteria
6、 Strain Producing Halophilic Lipase and Characterization of Crude EnzymeZHANG Meng1,2 ZHANG Xiao-Mei1 DOU Wen-Fang1 XU Hong-Yu1 XU Zheng-Hong1,2*(1. Laboratory of Pharmaceutical Engineering, School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)(2. The Key Laboratory
7、 of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)Abstract: A halobacteria strain Z4 producing extracellular halophilic lipase screened from Hypersaline lakes of Inner Mongolia was identified as Haloterrigena thermotolerans. The crude lipase from Z
8、4 was partially characterized using p-NPB. The activity of crude lipase was markedly increased 20%30% by metal ions (Ba2+,Fe2+,Cu2+), but was obviously decreased 20% by EDTA. The lipase was completely inhibited by PMSF. The activity and heat resistance of enzyme was increased by NaCl, suggesting tha
9、t the enzyme has strong dependence and specificity on NaCl. The thermostability of the crude enzyme was increased by alcohols, the glycerin is the best one. The optimum conditions for the crude lipase hydrolyzing p-NPB were followed: 3.5 mol/L NaCl, 70C and pH 8.0, and the optimum conditions for the
10、 crude lipase hydrolyzing p-NPP were followed: 2.5 mol/L NaCl, 80C and pH 8.0.Keywords: Halophilic lipase, Halophilic archaeon, Identification, Characterizationhttp:/ 脂肪酶在工业生物技术领域的应用逐渐成为研究的热点, 脂肪酶广泛应用于洗涤剂、食品、医药、制革、纺织及废物处理等领域1。脂肪酶按其作用特点主要可以分为碱性脂肪酶、酸性脂肪酶耐热脂肪酶和低温脂肪酶, 而来自嗜盐古生菌的嗜盐脂肪酶却鲜见报道。嗜盐古生菌是生长在盐湖、盐碱湖
11、、盐沼、死海和盐场等高盐环境中的一类微生物, 它是极端微生物的一个重要成员, 嗜盐古生菌最显著的生理特征是生长依赖高浓度NaCl, 生长最适盐浓度为3 mol/L 4 mol/L NaCl2。嗜盐古生菌产生的酶能在高盐的条件下维持高活性和稳定性, 而普通的酶在这种条件下失去活性, 正是由于嗜盐酶的这种独特性质, 来自于嗜盐古生菌的酶成为生物化学和酶学等基础研究中非常令人感兴趣的材料。Baratti等2006年首次报道了来源于嗜盐古生菌Natronococcus sp. TC6的嗜盐脂肪酶3, 而来源于嗜盐古生菌Haloterrigena thermotolerans 的嗜盐脂肪酶的相关研究并未
12、见国内外文献报道。本研究室从盐湖分离到一株嗜盐脂肪酶高产嗜盐古生菌Haloterrigena thermotolerans Z4, 并首次对其分泌的胞外嗜盐脂肪酶性质进行了初步研究, 为进一步开展嗜盐脂肪酶的应用研究奠定基础。1 材料和方法1.1 菌种Haloterrigena thermotolerans Z4分离自内蒙古锡林浩特地区盐湖样品, 样品由中科院微生物研究所马延和教授惠赠。1.2 培养基 种子培养基(g/L)：NaCl 200.0, KCl 2.0, MgSO47H2O 20.0, FeSO47H2O 0.04, 酪蛋白氨基酸 7.5, 酵母粉 10.0, 柠檬酸三钠 3.0,
13、pH 7.5发酵培养基(g/L)：NaCl 200.0, KCl 2.0, MgSO47H2O 20.0, FeSO47H2O 0.04, 酪蛋白氨基酸7.5, 酵母粉10.0, 柠檬酸三钠 3.0, 橄榄油10.0, pH 7.5筛选培养基(g/L)：NaCl 200.0, KCl 2.0, MgSO47H2O 20.0, FeSO47H2O 0.04, 酪蛋白氨基酸7.5, 酵母粉10.0, 柠檬酸三钠 3.0, 橄榄油 10.0, 若丹明B 1.0, pH 7.51.3 脂肪酶活力测定发酵液于4C、12000 r/min、离心15 min, 上清液即为粗酶液, 供酶学性质研究使用, 酶活
14、力测定以p-NPB为底物参照文献4方法进行。溶液A：176 L p-NPB溶于10 mL异丙醇, 4C保存; 溶液B：pH 8.0, 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(可根据需要调整pH)。使用时将溶液A与溶液B按1：9的体积比配制成3.6 mL底物反应液, 并在底物反应液中加入3.5 mol/L NaCl, 加入400 L粗酶样品, 37C反应10 min, 在410 nm测定吸光值。脂肪酶酶活单位的定义：每分钟释放1 mol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。1.4 菌种鉴定1.4.1 生理生化实验：按照伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)方法进行碳源利用试验、过氧化氢酶试验、硫化
15、氢试验、吲哚试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验等试验。1.4.2 16S rDNA序列扩增：PCR扩增利用古生菌通用引物：5-ATTCCGGTTGATCCTGC-35-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3扩增条件：95C 5 min; 95C 45 s, 50C 45 s, 72C 90 s, 30个循环; 72C 10 min。PCR产物测序由上海生工完成。1.5 粗酶性质研究1.5.1 酶最适作用温度：于不同温度按1.3方法测定脂肪酶活力, 以相对酶活绘制温度-酶活曲线。1.5.2 酶最适作用pH：以不同pH缓冲液配制底物反应液, 按1.3方法测定脂肪酶活力, 以相对酶活绘制pH-酶活曲线。1.5.3 酶最适作用盐浓度：配制不同NaCl浓度的底物反应液, 按1.3方法测定脂肪酶活力, 以相对酶活绘制盐浓度-酶活曲线。由于粗酶液含有3.5 mol/L的NaCl, 所以考查无NaCl 条件下的酶活时需将粗酶液用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液透析除去NaCl, 而其他NaCl浓度条件下使用未透析的粗酶液, 粗酶液中的NaCl浓度已计算在内。1.5.4 金属离子及抑制剂对酶活力的影响：在 10 mL未透析除盐的粗酶液中分别加入金属离子 (20 mmol/L)、PMSF(1 mmol/L)、EDTA二钠盐 (30 mmol/L)、SDS(5%, W/V)和DM
