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1、第一节 相衬显微镜(Phase contrast microscope)在光学显微镜的改进过程中，相衬显微镜的制造成功和普遍的应用，是近代显微镜技术中的重要成就。在 1935 年荷兰学者泽尼克提出了相衬法原理，至 1941 年由德国蔡司工厂诞生了世界上第一台相衬显微镜。它的产生，使人类的视觉在光学显微镜下又得到新的扩展。从信息利用的角度来看，人们将它视为光学信息处理概念下的第一个产品，因而获得了 1953 年诺贝尔奖金。我们知道，人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化的情况下，才能在显微镜下看到被检物体的存在，但活的生物体多是无色透明的，当光线通过时，波长和振幅变化不显著，这样在明场
2、镜检下就难于观察清晰。为了克服这一困难，可以采用一定的措施，如物理、化学处理法、材料经固定、染色等过程，使被检物体的颜色及亮度发生变化，但这只能观察已被杀死的材料，而不能观察到活体状态；当然，缩小聚光镜的孔径光阑，以增加明暗反差的对比，但这样不能充分发挥物镜数值孔径的性能，细微结构仍难于被分辨，同时镜象亮度也随之降低；利用暗场、荧光或偏光镜检术，虽然能观察活体标本，但这些显微术都是利用不同的光学原理，达到特定的观察目的，镜检效果局限在一定范围内。可见上述措施都不能得到满意的镜检效果，而采用相衬显微术，则能解决上述问题，使无色透明活体标本的细微结构在相衬显微镜下变得清晰可见。一、相衬显微镜的特点
3、相衬显微镜是利用被检物体的光程（折射率与厚度之乘积）之差进行镜检的方法。也即是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质亦成为清晰可见，这是普通显微镜难以达到的。这不仅大为便利了活体材料的观察，而且相衬显微术和普通染色观察相结合，还可判断“膺象”和真实的图象。相位和相位差光的传播具有波动性质，波动的能以平衡位置为准，以一定的振幅反复振动而前进。光波通过光学均匀体时， 单位时间（T）内波动的能所达到的位置，便是它的“相位” 。如图 4-2 所示，有 A、B 两束光，其中 A 光束只经过单一介质（如空气） ；而 B 光束在中途还通过一块透明玻璃，这样 B
4、 光束使受到阻滞而速度减少。因此，A 和 B 之间便产生了一定的相位差。相位差和振幅差示意图图 4-2在一定的介质内，波长决定了可见光的颜色，而振幅的大小则决定其亮度，这是为人眼所能分辨出的，但人眼不能分辨出相位差。因此，在普通显微镜下观察未经固定、染色的无色透明材料时，虽然被检物体各部分的折射率不同，并能使通过它的各组光线产生一定的相位差，也不能察觉出它们之间的差异，就是这个道理。图中的 A 光束和通过具有吸光物质的 C 光束之间，由于振幅的减少，使亮度减弱，则和 A 光束有着明暗的差别，这样就能为人眼所分辨。光源射出的光线通过被检物体时，如果某部分完全是均质透明体，则光线将继续前进，称直射
5、光；若某部分含有折射率或厚度不同的均质时，由于光的衍射现象则向周围侧方分散前进，这种光线称为衍射光。当直射光和衍射光两个光波达到一点时，则相互干涉，形成合成波。合成波的大小，取决于两个光波的振幅和相位差。如果振幅相等，相差为零，其合成波则有两倍的振幅，产生相长干涉（同向量） ，最为明亮；若一个光的相位推迟，其合成波减少，光度渐暗，当恰好推迟到半个波长（1/2 ）时，则两个光波相互抵消，合成波发生相消干涉（异向量） ，则成为黑暗状态。二、相衬显微镜的装置相衬显微镜因各厂家的制作形式不同，用法也略有各异，但其原理是相同的，在装置上都包括有：环状光阑、相板、中心（合轴）调整望远镜。（一）环状光阑(R
6、ing slit)：装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一整体相衬聚光镜。它是由大小不同环形光阑装在一圆盘内，外面标有 10、20、40、100字样，相应地与不同倍率的物镜配合使用。老式的常为单一环状光阑，附加在视场光阑的上部，它的大小依聚光镜下面安装的调节透镜来进行调节。（二）相板(Phase plate)：在物镜的后焦点平面处装有相板，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫“共轭面” ；另一是通过衍射光的部分，叫“补偿面”有相板的物镜称“相衬物镜” ，外壳上常有“PH”字样。相板上镀有两种不同的膜吸收膜和相位膜，吸收膜常为铬、银等金属在其真空中蒸发而镀成的薄膜，能把通过它的光
7、线吸收 6093%，可分为透过率为7%、15%、20%、40%四个档级。因此，分高（HIGH 略写 H） 、中（Medium 略写 M） 、低（Low 略写 L）及低低（Low-Low 略写 LL）四类。这样可根据被检物体的特性而加以选择应用。现将相衬物镜的选择方法列表于下。负相衬 Negative contrast (N) 正相衬 Positive contrast(P)适用于物体的形态、数量及活体情况的观察适用于物质内部细微结构的观察，同时也用于形态、数量和活体的观察负高(NH) 负中(NM) 正低(PL) 正低低(PLL)适用于折射率比较弱的被检物体适用于折射率比较强的被检物体适用于折射
8、率比较弱的被检物体适用于折射率比较强的被检物体相位膜常为氟化镁等在真空中蒸发成的薄膜，通过它的光线，相位被推迟，通常多为推迟 1/4 波长的相位膜，但有时因明暗反差过强，使镜检效果降低，而镀有推迟 1/3 波长的相位膜。相板的构造通常多为吸收直射光的类型，可分为负相衬(Negative contrast 略 N)和正相衬（Plosive contrast 略写 P）两类。（三）中心（合轴）调整望远镜，它实际是长工作距离，放大倍率约 45 的放大镜，用以调整环状光阑所造成的象与相板共轭面完全吻合。否则应被吸收的直射光被泄掉；对不该吸收的衍射光反被吸收；应推迟相位的部分有的不能被推迟，这样就不能达
9、到相衬镜检的效果。为了避免上述情况，必须使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上才能使两者吻合。当然在取下目镜后，在镜筒内也能看到两者的象，但因象很小，很难调节，利用中心调整望远镜安装在镜筒上加以放大而便于调节。三、相衬镜检的原理镜检时，光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光镜后，这束光线通过被检物体，因各部分的光程不同，光线将发生不同程度的偏斜（衍射） 。由于透明圆环所成的象恰恰落在物镜后焦点平面上，并和相板的共轭面重合。因此，未偏斜的直射光便通过共轭面；而发生偏斜的衍射光则由补偿面通过。由于相板的共轭面与补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，这样两组光
10、线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。干涉的结果，有的是振幅的同向量，合成波增大，即相长干涉，此部分便明亮；有的是振幅的异向量，合成波减少，即相消干涉，则此部分便暗淡。这样在相衬镜检时，通过无色透明物体的光线，使人眼不可分辨的相位差转变为人眼可分辨的振幅差。图 4-3 相衬光路示意图四、相衬显微术的负相衬与正相衬前已述及，在普通镜检情况下也产生相位差，但不能为人眼所能分辨。如图所示，被检物体小粒子的光程，一般要比周围大，所以通过小粒子的光比周围的光相位被推迟，因小粒子的衍射比直射光的速度大约低 1/4 波长。虽然直射光 A 与衍射光 B 形
11、成合成波 C，但因合成波的振幅与直射光相似，所以小粒子的象与背景之间不能形成明暗的反差，结果很难观察到小粒子象的存在。普通镜检下的光的干涉图 4-4在相衬镜检时，由于相板镀膜情况的不同，则有不同的镜检效果。如采用负相衬物镜时，由于相板的共轭面不仅镀有吸收膜，而且还镀有相位膜，除了吸收直射光使其振幅减小外，而且也把直射光的相位推迟 1/4 波长，这样使直射光与衍射光维持同一相位，则合成波等于直射波与衍射波振幅的和（相长干涉） ，因背景只有直射光的照明，而小粒子的象则比背景明亮。因此，负相衬的效果是“暗中之明”又称“明反差” 。负相衬镜检下的明反差图 4-5相反如用正衬物镜，由于相板的共轭面只镀有
12、吸收膜，补偿面则镀有相位膜，这样直射光仅被吸收，振幅减少，相位未被推迟；而衍射光的相位则被推迟 1/4 波长，使其与直射光的相位相差 1/2 波长，合成波的振幅等于两波振幅的差（相消干涉） ，这时小粒子的象要比背景黑暗。因此，正相衬的效果是“明中之暗” ，又称“暗反差” 。正相衬镜检下的暗反差图 4-6上述是被检物体小粒子的折射率大介质折射率的情况，如果它的折射率小于介质时，效果则完全相反。为了更好地发挥相衬镜检的效果，还应注意以下几个方面。1） 光源要强，因环状交阑遮掉大部分光源，同时应将视场光阑和孔径光阑完全开启；2）为了获得良好效果，应使用波长范围窄的近于单色的光源，相位的变化常因照明光线的波长而不同。通常采用绿色滤光镜来调整光源波长，最好按厂家专用相衬镜检的绿色滤光镜进行镜检；3）切片不能太厚，以 510左右为宜，否则将引起其它光学现象，而影响成象质量；4）载玻长、盖玻片的厚度应符合标准，且不应有疵痕，制片的封固剂应均匀一致。更多相关资料：http:/
