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1、1,专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价,一般毒性试验: 急性毒性试验 亚慢性毒性试验 长期毒性试验 特殊毒性试验: “三致”试验 致畸、致突变、致癌,2,第一节 一般毒性试验,一、急性毒性试验 (1)经口或注射给药的急性毒性试验 (2)经皮给药的急性毒性试验 目的： （1）求出受试物的半数致死量（LD50）。 （2）阐明受试物急性毒性的剂量-反应关系与中毒特征，为急救治疗措施提供依据。 （3）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提供依据。,3,经口或注射给药的急性毒性试验,1.动物 小鼠（体重1822g）、大鼠（体重180200g） 或其他敏感动物。应注明动物的品系。每组小鼠不 少
2、于10只、大鼠不少于6只，雌雄各半，雌性应未 产无孕。 2.供试药物的配制 一般用水为溶剂,将药物配成一定浓度的溶液.,4,3.给药方式与最大体积 灌胃法: 一次最大灌胃量 1.0ml/只(小鼠) 4.0ml/只(大鼠) 腹腔注射: 一次最大注射量 1.0ml/只(小鼠) 3.0ml/只(大鼠) 4.剂量与分组 预试验 全部致死的最小剂量LD100和全部存 活的最大剂量LD0 正式试验 5-7个剂量组,组间剂量呈等比级数, 其比值为1.2-1.4.,5,5.观察指标 动物一般健康状况，中毒表现和死亡过程。 时间：7天。 死亡动物：大体剖检、病理组织学检查（必要时） 6.LD50计算 寇氏法 计
3、算供试药的LD50值及其95%可信限范围。 7.结果判定 大鼠一次经口LD50在1 mg/kg以下为极毒，150 mg/kg为剧毒，50 500 mg/kg为中等毒，500 5000 mg/kg为低毒，5000 mg/kg以上者为实际无毒。,6,小鼠腹腔注射敌百虫LD50计算表,7,计算LD50，代入下列公式： lgLD50=Xk - d（ Pi 0.5) LD50 =Lg 1 Xk - d（ Pi 0.5) 式中Xk 为最大对数剂量, Pi为死亡率的总和; d为相邻两组剂量比值的对数, d=lg1.2=0.0792 则: LD50 = Lg 1 2.7938-0.0792(2.4-0.5)=
4、 Lg 1 2.6433 =439.87(mg/kg),8,经皮给药的急性毒性试验,1.动物 选用健康家兔（2.03.0 kg）、豚鼠(350450 g)或 大鼠(200300 g)，每组动物不少于6只，雌雄各半。 2.供试药物的配制 供试药物如是固体，应磨成细粉状，过120目筛，并用 适量水或无毒无刺激性赋型剂（橄榄油、羊毛脂、凡士 林等）混匀。如为液体，一般不要稀释。,9,3.给药方式 脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛 后24小时检查皮肤，如无损伤才能进行试验。将供试药 物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的10%， 用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防 脱
5、落和动物舔食。敷药24小时。试验结束后，用温水或 适当溶剂清除残留供试药。大鼠可采用浸尾方法给药。,10,4.剂量与分组 正式试验前，用少量动物做预备试验，根据24 小时内动物死亡情况，估计LD50的可能范围，以 确定正式试验的剂量。一般分为4个剂量组，组间 剂量呈等比级数。其比值为：1:1.5-3.0。若用赋 形剂，需设赋形剂对照组。,11,5.观察指标,观察动物的全身中毒表现和死亡情况，观察 时间为一周。若给药4天后仍有动物死亡时，仍 需继续观察一周，对死亡动物应做大体剖检，必 要时进行病理组织学检查。,12,6 . 结果判定 兔涂皮LD50在5 mg/kg以下为极毒，544 mg/kg为
6、剧毒，44 350 mg/kg为中等毒， 350 2180 mg/kg为低毒，2180mg/kg以上者为 实际无毒。,13,二、亚慢性毒性试验,确定外来化学物质在动物1/10左右的生命时间 内，反复多次接触后有无引起损害的观测过程。 又称短期试验、亚急性毒性试验（Subchronic toxicity test）。 目的：1.毒性确定 2.靶器官 3.慢性毒性试验依据,14,试验方法,1.动物 一般选用大鼠(100200g)或小鼠(1520g)。有条件时，采用供试药物的靶动物鸡等。外购动物需饲养一周后才能供试验用。,15,2.试验周期,16,3.给药方式,17,4.剂量与分组,大鼠 20只/组
7、，雌雄各半 对照组 低剂量组 高于有效量，不出现毒性反应 中剂量组 高剂量组 部分动物出现毒性反应或死亡 但死亡数不超过20%,18,5.观察指标,分六大项，具体指标为： （1）健康状况 每天 （2）体重，饲料消耗 2-3次/周 （3）血液学检查 定期 （4）血液生化学检查 定期 （5）肝、肾绝对重量和脏器指数 试验结束时 （6）剖检、组织病理学检查 试验结束时,19,6.结果处理,试验数据 方差分析或X2 病理变化 照片 写出评价报告,20,三、长期毒性试验,1.概念 外来化学物质在动物生命期的大部分时间或 终生接触于机体时所引起的损害作用，称为长期 毒性作用或慢性毒性作用。 确定外来化学物
8、质这种慢性毒性作用的动物 试验观察方法，称为长期毒性试验。,21,2.目的,观测长期反复摄入低剂量的受试物，可能对 机体造成的损害、严重程度、停药后的发展和恢 复情况，为临床试验提供依据。 3 . 试验方法 （1）动物 两种动物（啮齿类和非啮齿类），目前要求 用一种啮齿类动物进行全面系统的试验。,22,（2）剂量分组 试验组：45个，设高剂量组12个，中剂量组12个，低剂量组12个。 以LD50 的1/10、1/50、1/100、1/1000剂量分组。 对照组：1个 （3）染毒方式 混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。,23,（4）观察指标,一般情况：健康、生长发育、进食量，特别是体重。
9、生物化学指标：肝、肾功能。 血液学变化：Hb，WBC，RBC， 病理学检查 ： 病理解剖和病理组织学变化。 （5） 结果评价 参考亚急性毒性试验。,24,第二节 特殊毒性试验,致突变: 体外:（1）艾母氏(Ames)试验(必做) （2）哺乳动物培养细胞染色体畸变（CHO、CHL）选做 体内:（3）微核试验(必做) （4）精子畸形试验 选做 （5）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验 选做 （6）显性致死试验 若（4）、（5）任一项为阳性，必做（6）,25,致畸: （1）传统致畸试验(必做) 一般兽药必做 （2）喂养繁殖毒性试验 （3）喂养致畸试验 （2）、（3）饲料药物添加剂必须增做,26,一、艾母
10、氏(Ames)试验方法,1.原理 组氨酸缺陷型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨 酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培 养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成 组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长， 根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。,27,野生型（能合成组氨酸）,缺乏组氨 酸的培养基,加有致突变原 的培养基,组氨酸缺陷型（即突变型） 鼠伤寒沙门氏菌,。 。 。 。,28,2.菌种 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、 TA100、TA102 四个标准株。 3.剂量分组 每次试验要求4-5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高
11、剂量以不抑菌为原则。 液态受试物：0.05-50 ul/平皿 固态受试物：0.1-1000 ug/平皿，最高剂量可达5000 ug/平 皿。 选定后剂量的药物应配制成适当浓度 体积：100ul或200 ul/皿。,29,4. 溶剂 水 5. 对照物 每次检测均需要 阳性对照：已知的阳性药物 阴性对照：溶剂 加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿 6. S9混合液 如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有 致突变作用，则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳 动物的肝微粒体（S9混合液），使受试物被活化而呈现 致突变作用。,30,S9制备 选体重200 g 左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱
12、 导后宰杀（处死前12小时禁食）。在低温条件下， 无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中 制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或 80 冰箱。,31,7.试验步骤 TA97a TA98 TA100 TA102 37 水浴 振荡培养 活菌数不得少于12 x 109/ml,增菌培养液,增菌培养液,增菌培养液,增菌培养液,32,试验步骤,受检物 + 菌液 + S9混合液 或磷酸盐缓 （0.1-0.2ml） （0.1ml） （0.5ml） 37 水浴 振荡培养20imns 加入45 顶层 培养基2ml 混匀 37 培养48h,无菌小试管,含底层 培养基 的平皿,33,8.结果评价,受试组的菌落数
13、大于2倍自发回变数，并有剂 量反应关系和重现性，判为诱变阳性。,34,二、微核试验,原理： 骨髓细胞染色体经诱变物作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而存留于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，故称微核（micronucleus）。,35,图示,原理： 诱变物 嗜多染红细胞 微核直径相当于红细胞直径的1/201/5。,36,1.动物 成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。 10只/组，雌雄各半。 2.受试物的处理 将受试物溶于适宜的溶剂中,以0.1-0.2ml/1
14、0g体重的给 药体积配制成适当的浓度。 3.给药方式 给药途径：与临床用药途径相同。内服时需灌胃。 给药剂量：以LD50为依据，设三个剂量组。 高剂量组 LD50的0.8-0.5 ； 低剂量组 LD50的0.05-0.1 并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的 能诱发微核阳性的诱变剂。,37,4.试验操作 一次给药：24，48，72小时取样制片。 二次给药：第二次给药后的6，24小时取样制片。 处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。 姬姆萨染色，镜检。 5.镜检 计数： 1000 个嗜多染红细胞（PCE）/片 求出：嗜多染红细胞/正染红细胞（NCE） 必要时，丫啶橙染色，荧
15、光显微镜分析计数。,38,6.结果评价 将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及 PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复 试验P0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。,39,三、异常毒性检查,（一）目的 将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内 或口服给药，在规定时间内观察小鼠的死 亡情况，以判定供试品是否符合规定的一 种方法。,40,（二） 实验动物 小鼠 健康无伤， 体重1720g。 做过本实验的小鼠不能重复使用。,41,（三）检验方法,取5只小鼠，按药物的给药途径，每只小 鼠分别给予供试品溶液0.5ml。 静脉注射：尾静脉注入供试品溶液，注射时 间一般为45秒，规定缓慢注射的药品可延 长至30秒。 皮下注射：可见注射部位皮下出现泡状隆起。,42,（四）结果判定,除另有规定外，5只小鼠在给药后48小时 内不得死亡。如有死亡，另取体重1720g 小鼠10只复测，全部小鼠在48小时内不得 有死亡，否则，判为不合格。,43,第三节 制剂的安全性评价,一、热原反应试验 二、溶血性检查 三、局部刺激性试验 1. 家兔点眼法 2. 家兔股四头肌法 四、过敏性试验 五、降压物质检查,44,一、热原反应试验,1.概念 是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物,主要 是细菌的一种内毒素。 大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵 母菌也能产生热原。 热原随注射液进
