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1、邯郸学院本科毕业论文题 目 三黄片HPLC指纹图谱的研究学 生 指导教师 年 级 2006 级专 业 化 学系 部 化学系 邯郸学院化学系2010年5月郑重声明本人的毕业论文是在指导教师刘妍老师的指导下独立撰写完成的。如有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权的行为，本人愿意承担由此产生的各种后果，直至法律责任，并愿意通过网络接受公众的监督。特此郑重声明。 毕业论文作者： 年 月 日摘 要 本论文初步建立了三黄片的HPLC指纹图谱，为三黄片生产过程质量控制的依据和方法提供了参考。采用甲醇-磷酸（100:1）为溶剂,35超声提取45min后微膜过滤，获得供试品溶液。选取如下色谱条件：色谱
2、柱为 VP ODS C18(4.6mm150mm，5m)，柱温为30，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，以甲醇和0.2%的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。结果显示10批三黄片有19个共有峰，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得出其相似度98%。该方法简便可靠，可用于建立三黄片的指纹图谱，也可用于三黄片生产过程中的质量控制和对产品的质量评价。关键词 三黄片 高效液相色谱 指纹图谱14Determination of the Fingerprint Chromatogram of SanHuang tablet by HPLCDu Yi Directed by Vice Pro
3、f.Liu YanAbstract An effective and convenient method was established for HPLC fingerprints of SanHuang tablet which provided an approach for quality control in production. The chromatographic conditions are as follows: the column for the VP ODS C18 (4.6mm 150mm, 5m), the temperature for 30, a flow r
4、ate of 1.0ml/min, detection at 280nm, with acetonitrile and 0.2% phosphate acid aqueous solution for mobile phase gradient elution.The results showed that 19 peaks were indicated on the HPLC fingerprint of SanHuang tablet. According to the computer software-assisted analysis of similarity, the simil
5、arity of 10 batches of SanHuang tablet was not lower than 0.98. The method, which is simple and reliable, can be used to establish SanHuang tablet fingerprint and also be effectively used for quality evaluation and quality control in SanHuang tablets production. Key words SanHuang tablet HPLC Finger
6、prints目 录摘要I外文页II1序言12 实验部分22.1 仪器和药品22.1.1实验仪器22.1.2实验试剂22.1.3实验用药品22.1.4标准品32.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立32.2.1供试品的制备32.2.2色谱条件32.2.3方法学考察及相似度计算32.3批次药品的指纹图谱测定42.4特征峰的指认63讨论73.1色谱条件的选择73.1.1供试品制备条件的选择73.1.2流动相的选择73.1.3梯度的调整83.1.4波长的选择103.1.5柱温的选择113.2指纹图谱的相似度比较及差异分析114实验结果分析和展望11参考文献12致谢14三黄片HPLC指纹图谱的研究1序言中
7、药由于其成分的复杂性和作用的整体性、系统性1，而难以通过指标成分的测定进行有效地鉴别和评价。要实现中药研究“基本讲清药效成分，基本讲清作用机理”2的目标，就需要对中药的整体性进行评价。中药指纹图谱具有整体、宏观和半定量分析等特点，能够反应中药复杂成分内在质量的均一性和稳定性，成为目前国内外所广泛接受的一种中药评价技术1。尤其对一些有效成分尚不明确,或即使已知其成分但仍无法与构效一致时,中药指纹图谱是目前最能反映药材性质,并得到国际上认可的方法之一3。中药指纹图谱的评价系统4是指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行评价和控制。中药指纹图谱的评价5不同于定量分析
8、，它强调的是相似性（Similarity），而不是相同性（Identity），分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。相似性的比较可以用相似度表达，相似度就是借助国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”计算，一般情况下4相似度在0.91.0之间即认为符合要求。高效液相色谱(HPLC)具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，且HPLC不受样品挥发度和热稳定性的限制，适用范围广。利用HPLC非常适合构建中药指纹图谱。三黄片的处方源于东汉时期医圣张仲景所著金匮要略中“泻心汤”一方，历经千年而不衰。
9、该方由大黄、黄芩、黄连三药组成，故名“三黄”6。河北邯郸制药厂于1958年在大量研究的基础上将该方由传统的汤剂改为片剂，名“三黄片”7。该药为中国药典2005年版一部所收载8。三黄片9主要由大黄(radix et rhizome rhei)、盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）和黄芩浸膏（extractum scutellariae）组成。辅料为淀粉、糊精、蔗糖、柠檬黄、明胶、桃胶、虫白蜡、二甲硅油。具有清热解毒、泻火通便的功效，用于三焦热盛所致的目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、牙龈出血、心烦口渴、尿赤便秘，急性胃肠炎，痢疾等。目前检索到的关于三黄片HPLC的研究大多为对
10、成分含量的分析。如冯看等10，建立了四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量测定方法；何军等11 ，建立了三黄片中盐酸小檗碱含量的HPLC测定方法；金玉12， 应用改进HPLC法测定了三黄片中黄芩苷的含量；祝忠民等13，采用HPLC法同时测定了三黄片中的盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量；毛泉明等14，建立了RPHPLC法同时测定三黄片中黄芩苷、小檗碱、大黄素和大黄酚的含量。对于三黄片的HPLC指纹图谱的研究，目前仅检索到一篇，张艳菊等15，用甲醇超声提取后残渣再用甲醇溶解得供试液，采用Grace-C18(4.5mm250mm,5m) 色谱柱，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，在254nm检测波长
11、下，分析时间1 10min，进行了不同厂家三黄片HPLC指纹图谱的比较。得到了16个共有峰，相似度较好。关于三黄片主要成分的HPLC指纹图谱的研究很多，如刘欣等16，研究了大黄的HPLC指纹图谱；王龙虎等17，以盐酸小檗碱为参照测定了黄柏药材及中药饮片的HPLC指纹图谱；肖丽和等18，对黄芩属四种药材的HPLC指纹图谱进行了初步研究。三黄片指纹图谱的研究有助于更好的评价其内在质量，提高中成药质量评价的技术水平和科技含量，有一定的必要性。该研究可为进行药材植物资源的进一步开发利用提供参考数据，为中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台，对中药现代化的战略行动具有科学的指导意义。三黄
12、片价格便宜，疗效显著，应用广泛。目前，全国有近200家企业生产三黄片19,但尤为邯郸制药厂（现名邯郸摩罗丹药业股份公司）生产的的华山牌三黄片最地道，不但采用原料上成地道，而且工艺精湛，是唯一获得过国家银质奖的优质产品20。作为邯郸市地方院校，对于邯药三黄片进行指纹图谱的研究，具有很强的必要性和可行性。本论文主要从以下方面进行三黄片HPLC指纹图谱的研究：三黄片供试品的制备，选定检测波长和柱温，以一定配比的流动相进行梯度洗脱，确定最佳色谱条件，从而建立三黄片的HPLC指纹图谱。并在此基础上利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算。2实验部分2.1 仪器和药品2.1.1实验仪器LC-201
13、0A HT高效液相色谱仪（岛津国际贸易有限公司）；SHZ-D()循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；KW5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3C型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；AE240S型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）2.1.2实验试剂表1 实验试剂试剂纯度含量厂名甲醇分析纯99.5%天津市红岩化学试剂厂甲醇分析纯99.5%西陇化工股份有限公司乙腈分析纯99.9%天津市光复精细化工研究所纯净水食用级杭州哇哈哈集团有限公司冰乙酸分析纯99.5%天津市瑞金特化学品有限公司磷酸分析纯85%天津市瑞金特化学品有限公司乙醇分析纯99.7
14、%天津市红岩化学试剂厂丙酮分析纯99.5%天津市红岩化学试剂厂2.1.3实验用药品本实验选用邯郸摩罗丹药业股份公司（原邯郸制药有限公司）生产的华山牌三黄片，对10个不同批次的药品进行分析，药品均购自邯郸市各零售药店。药品批号如下：1512；109286；109486；109488；109606；109609；109557；110003；110012；110048。2.1.4标准品大黄酸，大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，盐酸小檗碱，均为自制。2.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立2.2.1供试品的制备取三黄片两粒，除去包衣，研细，精称0.25g于10ml容量瓶中，用甲醇-磷酸（100:1）溶解并定容至刻度，在35下超声提取45min，超声后补足溶液至刻度，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。2.2.2色谱条件色谱柱：VP ODS C18(150mm4.6mm,5um)；体积流量：1.0ml/min；柱温：30；检测波长280nm；进样量：10ul；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱。梯度洗脱条件见表2。表2 甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱条件时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）0572224313344506065705153043435050587
