1LSA-5B 型大孔树脂纯化沙枣多糖的工艺研究作者：吕新建 1 ，廉宜君，刘红，汪河滨 3，李炳奇【关键词】 沙枣多糖; 大孔树脂; 吸附; 解吸沙枣 Elaeagnus angusti folia L.又名香柳、银柳、七里香等，属胡秃子科落叶小乔木或灌木，在我国主要分布在大约北纬 34度以北的西北各省(区) [1]据《新疆中草药手册》记载，沙枣能“强壮，镇静，固精，健胃，止泻，调经，利尿” ，临床上多用于脾胃虚弱、消化不良、肠炎腹泻、肺热咳嗽等疾病的治疗，是我国新疆和伊朗、土耳其民间治疗呕吐和胃胀的传统药方[2～4]沙枣多糖 (EAP) 作为植物多糖的一种，是沙枣的主要活性成分之一，研究表明沙枣多糖具有抑制呼吸道合胞病毒[5]、降脂减肥、抗氧化和免疫调节等作用[6]本论文以 LSA-5B型大孔吸附树脂为分离纯化沙枣多糖的材料，研究其对沙枣多糖的吸附及解吸性能，确定其最佳吸附及解吸条件1 材料与仪器1.1 材料 LSA-5B大孔树脂 (西安蓝晓科技有限公司)、沙枣(购自石河子农贸市场)、葡萄糖(D-Glc)标准品(中国药品生物制品鉴定所)、层析柱(中国科学院昆明植化所)1.2 试剂碳酸氢钠、正丁醇、95%乙醇、苯酚(天津化学试剂厂)、三氯甲烷、浓硫酸、盐酸(乌鲁木齐化学试剂厂)、氢氧化钠(西安化学实剂厂)以上均为分析纯。
1.3 仪器 LD隆达 HF-2.5B超声循环提取机(北京弘祥生物技术开发有限公司)、KQ-250B型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)、Spectrumlab 54 紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)、Büchi Rotavapor旋转蒸发仪(瑞士 Büchi Labotechnik AG)、RE52-05 型旋转薄膜蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、TDL-5 型台式离心机(上海安亭科技仪器厂)、BS210 电子分析天平(德国 Sartorius公司)、电子天平(上海精密仪器科学有限公司)、HJ-4 型多头磁力搅拌器(金坛市恒丰仪器厂)、精密 pH计(上海雷磁仪器)2 方法2.1 大孔吸附树脂的预处理[7]将树脂装入吸附柱中，并保持 95%乙醇液面高出树脂面约 10 mm，浸泡 12 h用 95%乙醇洗涤树脂层，直至流出液加二倍蒸馏水不呈白色浑浊，用蒸馏水继续洗至无醇味即可2.2 沙枣多糖供试液的制备 称取适量的沙枣晒干并去核，称取 500 g沙枣粉末，以 1∶8 的质量体积比加入 4 L蒸馏水浸泡 24 h抽滤,合并滤液，浓缩用 95%乙醇使水和沙枣多糖液的含醇量为 80%醇沉在冰箱里过夜。
醇沉后，再用2Sevage法[8]除蛋白质 4次2.3 葡萄糖标准曲线的绘制从配制好的 0.1 mg/ml葡萄糖液中分别取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 ml共 9次，加蒸馏水到 1 ml，再加 1ml 5%的苯酚溶液和 5 ml浓硫酸，放 25 min，后在 490 nm下测定吸光度 A以不加样为空白，以浓度 C对吸光度 A回归,回归方程为：A=0.009 1C-0.022 7，R=0.999 72.4 沙枣多糖的含量测定方法用硫酸-苯酚法测定沙枣多糖溶液中多糖的含量，在 490 nm测其吸光度值，并带入回归方程计算多糖含量2.5 LSA-5B型大孔吸附树脂对沙枣多糖的吸附试验2.5.1 上样液 pH值的选择选取 pH值为 8,9,10,11,12的沙枣多糖溶液作单因素实验，实验结果如图 1所示图 1 上样液 pH值对沙枣多糖吸附效果的影响如图 1所示，随着上样液 pH的增加吸附率增大，但当 pH值大于 11吸附量有所下降，故选取 pH值为 9，10，11 为 3水平正交实验数据2.5.2 上样液浓度选择 选取浓度为 0.3，0.4，0.5，0.6 mg/ml 的多糖溶液作单因素实验，实验结果如图 2所示。
图 2 上样液浓度对沙枣多糖吸附效果的影响如图 2所示，随着上样液浓度的增加吸附量也增大，但浓度大于 0.5 mg/ml时吸附量开始下降，因此，选取浓度为 0.4，0.5，0.6 mg/ml 的上样液为 3水平正交实验数据2.5.3 正交动态吸附实验根据单因素实验得到的结果为依据，设计 3因素 3水平正交实验如下表 1 3因素 3水平正交实验水平上样液浓度C/mg·ml-1 pH值 上样量 (BV) 1 0.4 9 2 2 0.5 10 3 3 0.6 11 4表 2 动态吸附正交实验从表 2可知，贡献值从高到低依次为 pH值>上样液量>上样液浓度，且当正交表上为 A2B3C3时条件最优，故可知 pH为 11，浓度为 0.5 mg/ml，上样量为 4BV是 LSA-5B型大孔吸附树脂对沙枣多糖吸附的最佳条件2.5.4 验证实验按 pH为 11，浓度为 0.5 mg/ml，上样量为 4 BV为上柱条件，重复结果见表 3表 3 验证实验结果2.6 LSA-5B型大孔吸附树脂对沙枣多糖的解吸试验2.6.1 洗脱剂的浓度对解吸率的影响 分别用 3 BV浓度为40%，45%，50%，55%，60% 的乙醇,以 2 BV/h的解吸速率进行洗脱,收集洗脱液，计算沙枣多糖的解吸率。
结果见图 3所示图 3 乙醇浓度对沙枣多糖解吸效果的影响由图 3可得, 随乙醇浓度的增大,沙枣多糖解吸率逐渐增大当乙醇浓度达到 55%时,解析率已趋于稳定2.6.2 洗脱速率对解吸率的影响分别用洗脱速率为：1 BV/h，2 BV/h，3 BV/h，4 BV/h进行洗脱,计算沙枣多糖的解吸率结果见表 4图 4 洗脱速率对沙枣多糖解吸效果的影响 由图 4可得, 当洗脱速率为 2 BV/h时，沙枣多糖的解吸效果最好32.6.3 洗脱剂用量对解吸率的影响 用 55%乙醇进行洗脱,收集洗脱液 1.5 BV后,每 10 ml为一次样,并记录洗脱液体积,并计算解吸率结果见表 4表 4 乙醇用量对沙枣多糖解吸效果的影响由表 4可得，随着乙醇用量的增加，沙枣多糖解吸率也随着增大,当洗脱剂用量达到 2 BV时解吸率已趋于稳定2.6.4 双因素实验为确定沙枣多糖解吸效果的最佳条件,以乙醇浓度和洗脱速率为主要试验条件,做洗脱剂浓度与洗脱速率的双因素实验结果见表 5表 5 洗脱剂浓度和洗脱速率双因素实验由表 5可得，沙枣多糖解吸效果的最佳条件:洗脱剂浓度为 55%乙醇,洗脱速率 2 BV/h，洗脱剂用量 2 BV。
4 小结通过正交实验和极差分析，影响 LSA-5B大吸附孔树脂对沙枣多糖吸附效果的因素大小为：pH 值>上样量>上样液浓度LSA-5B 型大孔树脂吸附沙枣多糖的最佳条件为:上样液浓度 0.5 mg/ml, pH值 11,上样量 4BV且吸附率达到74.03% LSA-5B 型大孔树脂解吸沙枣多糖的最佳条件为:洗脱剂浓度 55%乙醇,洗脱剂速率 2 BV/h,洗脱剂用量 2 BV且解吸率达到 95.49%参考文献】[1] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海:上海科技出版社,1997：1162.[2] 新疆生物土壤沙漠研究所.新疆药用植物志，第二册[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社, 1981：76.[3] 黄俊华,买买提江,杨昌友,等.沙枣研究现状与展望[J].中国野生植物资源, 2005, 24(3): 26.[4] 辛艳伟.沙枣的开发和利用[J].安徽农业科学, 2007, 35(2): 399.[5] 田丽丽.沙枣多糖抗呼吸道合胞病毒作用及其机制研究[D].长春：吉林大学, 2005.[6] 白云龙.沙枣多糖对大鼠降脂减肥及抗氧化作用的研究[D].长春：吉林大学,2007.[7] 何 伟,李 伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用[J].南京中医药大学学报, 2005,21 (2) :134.[8] 夏 泉，刘 钢.Sevage 法去除黄芪粗多糖中蛋白质成分的研究[J].安徽医药,2007,11(12) 1069.。