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1、第9课时 生物成分的分离与测定技术,第四章 生物化学与分子生物学技术实践,学习导航 1.掌握电泳法分离大分子的原理。 2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。 3.尝试从血清中提取和分离血红蛋白。 4.了解芳香油的特点，知道提取芳香油的原理及会设计简单的实验装置 进行提取。 重难点击 1.电泳法分离大分子的原理。 2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。,一、蛋白质的分离与纯化,二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,内容索引,当堂检测,三、凝胶色谱法分离血红蛋白,四、从生物材料中提取某些特定成分,一、蛋白质的分离与纯化,1.分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括 、 、 和 等。采用 的方法可以将所带电荷的数量
2、和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来；采用_ 和脂溶性有机溶剂提取法可以分离生物组织中的脂肪。,基础梳理,离心沉降法,薄膜透析法,凝胶色谱法,电泳法,醋酸纤维薄膜电泳,水蒸气,蒸馏法,2.蛋白质分离的抽提方法,偏碱性,偏酸性,有机溶剂,3.蛋白质的分离方法 (1)离心沉降法：通过控制 ，使分子大小、 不同的蛋白质发生沉降分层。 (2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过 的特性，使 与其他小分子化合物分离的方法。,离心速度,密度,半透膜,蛋白质,(3)凝胶色谱法 概念：根据 的大小差异对其进行有效分离的方法。 原理,a.凝胶,形态：微小的多孔球体 组成：大多由 构成 结构：内部具有很细微
3、的_,蛋白质分子量,多糖类化合物,多孔网状结构,b.分离的过程,容易,较慢,较短,(4)蒸馏 概念：将液体加热至沸腾，使液体变为 ，然后使蒸气冷却再凝结为 ，这两个过程的联合操作称为蒸馏，是分离和提纯液态混合物常用的方法之一。 分离物质的种类 a.易挥发和不易挥发的物质。 b.液体混合物中 不同的物质。 (5)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。,蒸气,液体,沸点,问题探究,欲研究某种蛋白质的结构、性质和功能，需将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。结合教材，完成下列内容： 1.怎样释放细胞中的蛋白质？ 答案 在提取蛋白质时，可以采用研磨和超声波结合的方法将
4、生物组织或细胞完全破碎，使蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的抽提液中。,答案,2.离心沉降法分离蛋白质 (1)完善右面离心沉降法分 离蛋白质的示意图 (2)观察并总结离心沉降法 分离的原理及其目的：通过 控制 ，使 、 的蛋白质发生沉降 分层，从而达到分离出不同 种类蛋白质的目的。,蛋白质,离心速度,分子大小,密度不同,利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，从而使蛋白质与其他_ 分离开，达到纯化蛋白质的目的。,3.薄膜透析法分离蛋白质 仔细观察下面薄膜透析法分离蛋白质的示意图，完成下列问题：,小分子,化合物,4.凝胶色谱法,(1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子
5、洗脱后的次序。,较大,较小,垂直向下运动,较快,较长,(2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？ 答案 相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 (3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？ 答案 不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。,答案,解析 凝胶
6、色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的蛋白质分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。,拓展应用,1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是 A.相对分子质量较小的蛋白质 B.相对分子质量较大的蛋白质 C.凝胶颗粒 D.葡萄糖或琼脂糖分子,答案,解析,2.蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是 A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋
7、白质 分离 B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳法分离蛋白质 C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质,答案,解析,问题导析,问题导析 (1)薄膜透析法是利用了蛋白质分子不能透过 的特性，将蛋白质与其他小分子物质(如无机盐、单糖、二糖以及氨基酸)分离开来的提纯方法。 (2)蛋白质所带 的性质能决定其在电泳槽中的移动方向，分子的大小能影响其移动速度。 (3)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的 对其进行有效分离的方法。 (4)离心沉降法是通过控制离心 ，使分子 、 不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到
8、分离出不同种类蛋白质的目的。,答案,返回上页,半透膜,电荷,大小差异,速度,大小,密度,解析 蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质。,返回上页,(1)本题四个选项涉及的提纯方法中，哪种不适合将不同种类的蛋白质分离？为什么？,答案 薄膜透析法。因为薄膜透析法的原理是根据蛋白质不能通过半透膜的特性，该方法仅可将蛋白质与其他一些小分子物质分离，而不适合将不同种类的蛋白质分离。,(2)电泳法中影响蛋白质移动速度的因素除了分子大小外，还有哪些因素？,答案 颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少，此外还有电场强度、溶液的pH等因素。,答案,蛋白质分离技术的原理 (1)薄膜透析
9、法：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。 (2)离心沉降法：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的蛋白质分子沉降速度不同，从而被分离。 (3)凝胶色谱法：凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。 (4)电泳法：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。,二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,基础梳理,1.结合教材，完善下表,巴比妥缓冲,透
10、明,支架前沿,气泡,记号,巴比妥缓冲液,记号,2 cm,记号,正极,6090,染色液,蛋白质区底色脱净,透明液,透明薄膜,2.实验结果,问题探究,1.本实验的关键步骤是点样，点样的技术要求有哪些？ 答案 点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。,答案,2.实验结果分析 (1)血清蛋白主要包括几种蛋白质？含量大小如何？ 答案 从电泳图谱示意图中可以看出：血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：球蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白。 (2)这些蛋白质带什么电荷？四种球蛋白的泳动速度如何？ 答案
11、 由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带有负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为：1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。,答案,关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明 (1)薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 (2)点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 (3)点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 (4)点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适中，不宜过多或过少。 (5)电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 (6)应控制染色时间。时间过长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀
12、，必要时可进行复染。,解析 对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且球蛋白距点样处最近，所以球蛋白所带负电荷最少。,拓展应用,3.仔细观察右图，所带负电荷最少 的球蛋白是 A.1球蛋白 B.2球蛋白 C.球蛋白 D.球蛋白,答案,解析,电泳的泳动规律 带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。,4.下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是 A.架滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上 B.浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号 C.平悬薄膜时
13、，有记号的一面朝上 D.从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色,解析 薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止，然后才用透明液脱色。,答案,解析,三、凝胶色谱法分离血红蛋白,1.研究目标 (1)红细胞中含有大量的血红蛋白，一分子 由四条肽链构成(两条肽链和两条肽链)，由于其肽链中结合了血红素而呈现出 色。 (2)可利用 血液分离血红蛋白。 2.实验器材 猪、羊等血液； ；交联葡聚糖凝胶，20 mmol/L磷酸缓冲液等。 3.实验目的 利用 分离血红蛋白。,基础梳理,血红蛋白,红,哺乳动物,色谱柱,凝胶色谱法,4.实验步骤 (1)样品处理： 离心分离红细胞。
14、用滴管吸出上层血浆后，将下层红细胞倒入盛有约5倍体积的质量分数为0.9%的NaCl溶液(生理盐水)的烧杯中搅拌后再低速离心，重复3次，直到红细胞被洗净，上清液不再呈现黄色为止。,低速短时间,(2)血红蛋白的释放、分离和透析 在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂而释放出血红蛋白。 将混合液以2 000 r/min 的速度离心10 min，试管中形成 层(自上而下分别为甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白层、杂质层)；用滤纸过滤其中的液体，除去 ；用分液漏斗分离出下层的 (血红蛋白溶液)。 在透析袋中加入1 mL红色透明液体，放入物质的量浓度为20 mmol/L的 中(pH为7.0)透析 。,4,脂溶性沉
15、淀层,红色透明液体,磷酸缓冲液,12 h,(3)凝胶的制备 将 用蒸馏水充分溶胀后，制成凝胶悬浮液。凝胶的溶胀一定要完全，否则会导致 ，并产生气泡。 (4)色谱柱的装填 将层析柱洗净，垂直固定在支架上，选择 (100目尼龙纱)端作为层析柱下口。 打开色谱柱下端的乳胶管开口，将充分溶胀的凝胶悬浮液轻轻搅动均匀，沿 内壁缓缓一次性倒入色谱柱内。 立即连接 ，在约50 cm高的操作压下，用 (pH为7.0，物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液)充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。,交联葡聚糖凝胶,色谱柱装填不均匀,有薄膜,层析柱,洗脱瓶,洗脱液,(5)样品的加入 打开 下端的流出口，让凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与 刚好平行，关闭出口。 用滴管小心吸取1 mL样品溶液沿 轻轻地加入到色谱柱顶端，不能破坏凝胶面。然后，打开流出口，使样品液逐渐渗入凝胶。 当样品恰好完全渗入凝胶床时，再加入少量的 (pH为7.0，物质的
