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1、第2课时 分离以尿素为氮源的微生物,第一部分 微生物的利用,考试要求,一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备,二、分离以尿素为氮源的微生物,内容索引,当堂检测,一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备,基础梳理,1.实验目的 (1)使用专一的培养基(含有 )分离专一的细菌(有 的细菌)。 (2)利用指示剂颜色的变化检知酶( 酶)所催化的反应。 2.实验原理 (1)脲或称尿素，是 的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的 。 (2)(NH2)2COH2O _,尿素,脲酶,脲,蛋白质降解,氮源,2NH3,CO2,3.设备及用品 灭菌锅或高压锅、250 mL的三角瓶1个和100
2、 mL的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、 和玻璃刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和 、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管(15 mm150 mm)5支和试管架、 。 4.实验材料 (1)在100 mL烧杯中装入50 mL 70%酒精，将 浸泡在其中。 (2)在100 mL三角瓶中配制好25 mL (0.25 g蛋白胨，0.12 g酵母提取物，0.25 g NaCl和0.5 g琼脂糖，水25 mL)，加上封口膜后 待用。,接种环,超净台,移液器,玻璃刮刀,全营养LB固体培养基,灭菌,(3)在100 mL三角瓶中配制好25 mL尿素固体培养基(0.025 g葡萄糖，0.1
3、2 g NaCl，0.12 g K2HPO4，0.25 mg酚红和0.5 g琼脂糖，水15 mL)，加上封口膜后 ，待冷却至60 时，加入通过 (使之无菌)的10 mL (内含2 g脲)，摇动，混合均匀后待用。 (4)将盛有4.5 mL 的5支有塞试管灭菌后待用。 (5)在250 mL三角瓶中装入99 mL蒸馏水，用封口膜盖上， 后待用。 (6)土样1 g(从 的地方取得)。,灭菌,G6玻璃漏斗过滤,尿素溶液,蒸馏水,灭菌,有哺乳动物排泄物,问题探究,1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？ 答案 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非
4、尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量非以尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。,答案,2.分离以尿素为氮源的微生物实验所用培养基为 培养基。在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是 ，提供氮源的是 ，琼脂糖的作用是 。 3.微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。据此该培养基对微生物具有 作用，其选择机制是只有_ 的微生物才能在该培养基上生长。,答案,尿素固体,葡萄糖,尿素,凝固剂,选择,能够分泌脲酶,从而以尿素作为氮源,4.有脲酶的细菌在生态系统稳态中起什么作用？ 答案 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高
5、温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子物质如 等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。,答案,5.酸碱指示剂是用来指示反应前后的酸碱性变化的。尿素在被脲酶作用前是 性的，而作用后产生了NH3，变成了 性，本实验使用 作为指示剂，在酸性情况下呈 色，碱性情况下呈 色，变色范围是pH6.48.2。培养后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，培养基中的尿素分解产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色，这就表明 。圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。,答案,中,碱,酚红,黄,红,以尿素为氮源的细菌分
6、泌了脲酶并分解了尿素,活学活用,1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出 A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌 C.固氮细菌、霉菌、放线菌 D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌,答案,解析,解析 固氮细菌可以在无氮培养基上生长； 青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长； 加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。,2.下列有关叙述，不正确的是 A.脲是一种有机化合物
7、，含有氮元素 B.地表土壤中含有一定量的脲 C.以尿素为氮源的细菌含有脲酶 D.在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性,答案,解析,解析 根据反应式：(NH2)2COH2O 2NH3CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。,二、分离以尿素为氮源的微生物,基础梳理,1.实验中的对照设置 (1)实验组：以 培养基进行培养。 (2)对照组：以 培养基进行培养。 2.实验步骤 制备培养基：将已灭菌的 和 分别倒入 两个培养皿中，摇匀，平放至凝固 制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液 ,LB固体培养基,尿素固体培养基,尿素固体,全营
8、养LB固体,用涂布分离法分离细菌：将 分别加入有LB培养基 和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布 到整个平面上 培养：倒置培养皿，在 恒温箱中培养2448 h 观察：培养基中_,不同浓度的土壤稀释液,37,菌落数,问题探究,阅读教材，回答问题： 1.实验原理 (1)以尿素为氮源的微生物含有 酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。 (2)尿素固体培养基的唯一氮源为 ，只有能合成 的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源生长繁殖，缺乏 的微生物则由于不能分解尿素而不能生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选分离出以 为氮源的微生物。 (3)脲酶可使尿素分解产生氨，从而可使加入酚红指示剂的尿素固体培养基变
9、。,答案,脲,尿素,脲酶,红,脲酶,尿素,2.实验步骤 (1)在60 左右时，将两只三角瓶中已灭菌的 培养基和_ 培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的 上摇匀，平放至凝固。,答案,LB固体,尿素固体,超净台,(2)制备 (过程如图1)。在无菌条件下，将1 g土样加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即成 土壤稀释液。依此法制备 、 和 土壤稀释液。取样时，尽量只取 。摇匀，放在试管架上。,答案,细菌悬液,102,103,104,105,悬液,答案,(3)用 法分离细菌(如图2)。取 和 的土壤稀释液各 ，分别加到有 和 的培养皿中，再将保存在 中的 放在 上，待刮刀上
10、火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 (4)将培养皿 ，在 中培养2448 h。观察菌落数。,涂布分离,104,105,0.1 mL,LB培养基,尿素培养基,70%酒精,玻璃刮刀,酒精灯火焰,倒置,37 恒温箱,答案,3.观察结果(如图3) 中有较多的菌落，而 为氮源的培养基平板中只有 少量菌落。,全营养培养基,尿素,答案,4.思考与讨论 (1)样品为什么要进行稀释？有什么标准？ 答案 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。稀释的标准：选用
11、一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30300，便于计数。,答案,(2)有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？ 答案 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨水为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境中变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源，红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。,答案,(3)与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？ 答案 这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数。因为人和其他哺
12、乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约500800 mL尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的。因此，以尿素为氮源的菌群较少。,答案,(4)2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？ 答案 配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。,答案,5.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用,未被杂菌污染,筛选,活学活用,3.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示： 请回答：
13、(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用 进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布 个平板，通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。,解析 涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。,无菌水,3,20,答案,解析,(2)接种后的培养皿 于37 的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的 产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。 解析 接种后需倒置培养皿恒温培养。含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基
14、呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。 (3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是_ 。 解析 分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。,答案,倒置,红色环带,酚红指示剂,以尿素,作为唯一氮源,解析,(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选) A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分 B.倒平板 C.涂布平板 D.微生物的培养 解析 进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。,答案,解析,(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是 。 解析 尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。,土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量,答案,解析,4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是 A.将土壤用无菌水稀释，制备103105土壤稀释液 B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上 C.用加入酚红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌 D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株 解析 从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液； 将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上； 用加入酚红指示剂的鉴
