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1、第14课时 蛋白质的提取和分离,第4章 现代生物技术,学习导航 1.阅读教材P7475内容，理解电泳、同工酶和蛋白质组学。 2.结合教材P7375内容，进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。 3.结合教材P7375内容，总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。 重难点击 1.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。 2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。,一、电泳、同工酶和蛋白质组学,二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离,内容索引,当堂检测,一、电泳、同工酶和蛋白质组学,基础梳理,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大
2、分子的重要手段。 1.电泳 (1)概念：带电粒子在 的作用下发生 的过程。 (2)原理 带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。,电场,迁移,可解离,正电或负电,迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其_ 的电极移动。 分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生 ，从而实现样品中各种分子的分离。,所带电荷,相反,带电性质的差异,大小,形状,不同的迁移速度,(3)常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带 以及分子的 等因素。 变性
3、胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为 形，SDS带有大量的 电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的 。,净电荷,大小和形状,椭圆,负,大小,2.同工酶 同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子 、 乃至 性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶一般含有 种同工酶，其相对分子质量 ，但所带电荷 。 3.蛋白质组学 蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的_ 分析、 研究和蛋白质的 等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白
4、质的 ，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的 。,结构,理化性质,免疫学,5,相同,不同,氨基,酸组成,立体结构,人工合成,组成,相互作用与联系,1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？ 答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。 2.变性胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？ 答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。,问题探究,答案,归纳总结,琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳的两点区别 (1)分离原理不同 琼脂糖凝胶电泳依
5、据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。 变性胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。 (2)用途不同 琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。 变性胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。,拓展应用,1.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于 A.所带的电荷多少 B.蛋白质的分子大小 C.蛋白质的相对分子质量 D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少,答案,2.下列说法中，不正确的是 A.同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同 B.同工酶的相对分子质量一定不同 C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性 D.蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的
6、前沿 解析 同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。,答案,解析,同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。,二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离,基础梳理,下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。 1.乳酸脱氢酶同工酶的提取 (1)取5 g新鲜的动物心脏， 干净后 到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL 液，然后 成匀浆(如图1)。,漂洗,剪碎,磷酸提取缓冲,冰浴研磨,(2)将匀浆收集到冰浴的 管中，在 条件
7、下12 000 rpm离心10 min。 吸取 ，然后在 条件下保存备用(如图2)。,离心,4,上清液,4,2.琼脂糖凝胶电泳分离 (1)制备琼脂糖凝胶：用 液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶， 后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量_ 液(如图3)。,TBE电泳缓冲,加热溶解,TBE,电泳缓冲,(2)加样：取适量同工酶提取液与等量 液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20 L加入 内。 (3)电泳： V条件下进行电泳约30 min。 (4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到 时切断电源，取出胶板浸入 中，
8、37 染色1530 min，水洗后观察电泳结果。,载样缓冲,样品孔,100,凝胶底部,染色液,3.结果分析,由图中电泳结果可以看出： (1)每个器官形成了 个条带说明 。 (2)LDH2在 中含量最高，在 中含量最低，说明_ 。 (3)骨骼肌中含量最高的是 ，含量最低的是 ，说明_ 。,5,乳酸脱氢酶有5种同工酶,心脏,骨骼肌,不同的器官同,一种同工酶的含量不同,LDH5,LDH1,同一器官,不同的同工酶含量不同,1.提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？ 答案 酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其
9、生化性质及相关功能。 2.制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？ 答案 提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。,问题探究,答案,3.溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？ 答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。,答案,归纳总结,(1)实验步骤概括：取材剪碎漂洗匀浆离心制凝胶加样 电泳染色冲洗观察。 (2)实验操作要点 所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的
10、活性。 蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。 将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动。,3.在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是 A.维持溶液浓度不变 B.维持溶液酸碱度不变 C.催化蛋白质分离过程顺利完成 D.无实际意义 解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。,答案,解析,拓展应用,4.下列说法不正确的是 A.在酶的
11、提取和分离过程中必须保持其生物活性 B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性 C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定 D.电泳结果出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶 解析 酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳结果出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。,答案,解析,琼脂糖凝胶电泳的优点 (1)琼脂糖含液体量大，近似自由电泳。 (2)琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。
12、 (3)电泳速度快。 (4)区带易染色，样品易回收，有利于制备。 (5)操作简单、快速、灵敏。,课堂小结,带电性质,大小,匀浆,电泳,染色,当堂检测,1.下列有关同工酶的概念，描述正确的是 A.催化相同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质不同，电泳行为 不同 B.催化不同的化学反应 C.催化不同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质相同，电泳行为 相同 D.催化相似的化学反应 解析 同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的一组酶。,2,3,4,1,答案,解析,2.乳酸脱氢酶有几种同工酶 A.2 B.3 C.4 D.5 解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。,答
13、案,解析,2,3,4,1,3.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因 A.分子带电性质的差异 B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度 解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。,答案,解析,2,3,4,1,2,3,4,1,4.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者的重视。分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的_ 不同而实现的分离。 解析 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,答案,解析,电荷(带电情况),迁移,速度,
