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1、22 液相色谱技术 Chromatography,背景,色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。,色谱法的基本原理,色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异
2、（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,慢 中等 快,色谱分离,22.1色谱的基本概念,固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。,分配系数 可由Langmu
3、ir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。,分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。,两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.,阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小.,洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。,理论板，理论板当量高度（
4、HETP），理论塔板数（N）、 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。 理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。 理论板当量高度：该段色谱柱的高度。,理论板数的计算方法,N-理论塔板数 tR-保留时间 W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：,L-柱长,22.2 色谱分离方法的分类,色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：,按操作形式不同分类： 柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄
5、层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。,按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱 按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱,22.3 各类色谱技术及应用,凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水色谱 聚焦色谱 反相色谱 超临界流体色谱 羟基磷灰石色谱 灌注色谱 应用,凝胶过滤技术,1)Gel filtration chromatography(GFC)原理 操作与原理：含
6、有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。 分子筛色谱: 从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。,分子筛凝胶色谱原理,分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt, 组分1-2在V0-Vt之间. 显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离,分配系数m影
7、响因素：分子量, 分子形状, gel孔径结构；与pH, I, T无关.,2)凝胶介质 对介质的要求： 1st 亲水性高； 2nd 表面惰性，不发生化学和物理变化； 3rd 高稳定性，有较宽的pH和I适应范围； 4th 具有一定的孔径分布； 5th 机械强度高，耐高压操作，寿命长。 商品化的介质均能满足1-4条的要求。 介质的类型： 1st Sephadex 2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex, Sepharose 4th Cellulose 5th TSKgel,凝胶介质特征参数 排阻极限(exclusion limit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如
8、，Sephadex G50的排阻极限为30kD。 分级范围(fractionation range)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。 溶胀率/吸水率： 如，Sephadex G50的溶胀率 = 500 30%。,凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150m之间；硬gel较小，在5-50m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。 床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如， Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。 空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙
9、体积，即V0。 空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(blue dextran)测定。,4)影响GFC分离特性的因素 线速度： 1st HW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m = 0，故HETP = 2Dz/u (Dz udp) = 常数。 2nd HW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m 0, HETP u; 在u = 0处，直线交于点 2Dz/u。 3rd 当u 0.2 cm/min, NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。,进样体积： 1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数； 2nd 但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加
10、而急剧增大。 3rd 意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。 料液浓度 依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。,分子量M和分配系数m 1st 在GFC分级范围内m与M关系 此时，分离度方程为 方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。 2nd 因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。,凝胶的粒径 1st dp, HETP.故dp是N
11、的最佳途径； 2nd dp10倍, 而h和v不变，u10倍， HETP(=hdp) 10倍，R10倍,5）应用 1st 分离纯化 M：x0-106， d: 0.x-x00nm之间； 种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。 2nd 除热原、过敏原 如青霉噻唑蛋白 Sephadex G25凝胶柱。 3rd脱盐/置换buffer,4th M测定 原理： 挑选标准蛋白质：cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500). 条件：在凝胶介质分级范围内. 作图：,6）优点 1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉
12、易得；适合于大规模生产； 2nd 溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%； 3rd 分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； 4th 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。 5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。 7）缺点 1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少； 2nd 经GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。,离子交换色谱,以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,原理 (ion exchan
13、ger chromatography, IEC) 1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离子强度；A和B为常数, 均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m-离子强度无限大时的溶质分配系数, 为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。 2nd 意义：对于pro.和aa 调节I value 调节|pH pI| value,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂
14、DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列,操作 1st 恒定洗脱(Sephadex常用) 缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽,2nd 线性梯度洗脱
15、(linear gradient elution) 线性梯度洗脱的优缺点 优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。,3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution),优点：无须特殊设备，操作简单； 缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。,线性洗脱时间 定义：GH dI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s). 利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr,分离度和柱效 1st 分离度 意义：4因素可控制 2nd 柱效 意义：,I+dI I,mi,富集效应,应用：,疏水性吸
16、附色谱(hydrophobic interaction chromatography, HIC),原理 1)吸附 1st pro疏水性 2nd pro稀疏水性差异 3rd 原有吸附介质的亲水性 4th 亲水性介质的改造,2)影响pro水化层因素 1st 水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2nd ionic strength 3rd |pH水 pI| Value |pH水 pI| Value zeta电势 水化层 4th 增加亲水性物质 离子：SCN-，ClO4-，I- 有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质 5th 表面活性剂,Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell,
