《鸡贫血病毒Apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析【医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鸡贫血病毒Apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析【医学论文】（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、医学论文-鸡贫血病毒 Apoptin 蛋白编码基因的克隆和序列分析作者：刘德纯 王健生 王作仁 段小艺 陈武科 杨广笑【摘要】 目的：为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白，克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒 Apoptin 蛋白的编码基因并进行序列分析. 方法：根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的 DNA 作模板，通过 PCR 获得了特异扩增产物,将其插入到 pGEMTeasy 载体并转染感受态 E.coliDH5 菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后，使用 DNA 测序仪测定插入片段的 DNA 序列. 使用 DNAsis 分析软件分析所克隆的 DNA 序列及其编码蛋白质，并与数据库中Ap
2、optin 蛋白的编码基因相比较. 结果：序列分析表明，成功地克隆了鸡贫血病毒的 Apoptin 基因，同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的Apoptin 基因（GenBank AY171617）的核酸序列一致，同鸡贫血病毒全基因序列中的 Apoptin 序列（GenBank AF 313470）有 6 个核酸差异. 结论：Apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础. 【关键词】 鸡贫血病毒 凋亡素 克隆 测序0 引言鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)是由 DanenVan Oorschot 等1在 1979 年发现并能引起雏鸡贫
3、血死亡的一种环状病毒.CAV 基因组长度约2.3 kb2,能分别编码 VP1,VP2 和 VP3 三种蛋白质. 其中 VP3 蛋白是功能蛋白质,由 121 个氨基酸组成，它包含两个富含脯氨酸的序列和两个带正电的区域，具有诱导被感染鸡血细胞凋亡的活性,是鸡贫血病毒的主要致病因子,根据此特性将该蛋白命名为凋亡素（Apoptin）3. 在 Apoptin 诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制研究方面已取得较大进展4, Apoptin 能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，其发生作用不依赖 p53 基因，而且不被 Bcl2 过表达所抑制，因此这种 Apoptin 可能成为一种很有前途的能选择性地诱导肿瘤细胞和
4、转化细胞发生凋亡的药物.本研究旨在从自然生长的家鸡法氏囊中分离、提取 CAV DNA，通过 PCR 方法扩增 CAV 的 Apoptin 编码基因，将其插入克隆载体 PGEMT 中,使用双脱氧终止法测定插入片段的 DNA 序列，同 Genbank 的数据库比较证实获得了 CAV 的Apoptin 编码基因克隆，为研究 Apoptin 治疗肿瘤奠定了基础.1 材料和方法1.1 材料 4 只低体质量（1400 g），低产卵的 3 月龄雌鸡（购于西安市郊区某鸡场）;PGEMT 质粒、E.coliDH5 （西安市华广生物工程有限公司实验室提供）. 耐热的 TaqDNA 聚合酶、各种限制性内切酶、DNA
5、 聚合酶、T4 DNA 连接酶、蛋白酶 K, DNA Mr 标准，华美生物公司；E.coliDH5 受体菌，华广生物工程公司.1.2 方法1.2.1 病毒 DNA 提取将鸡颈静脉放血处死，立即分离法氏囊，置液态氮冷冻保存；取 100 mg 冷冻组织，在 1 mL 的匀浆缓冲液（50 mmol/L TrisHCl, 100 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0）中制备组织匀浆；取 500 L 匀浆加入 SDS 和蛋白酶 K，使其终浓度分别为 1 和 200 mg/L，37温育 120 min消化组织蛋白，消化后加入等体积的酚和氯仿/异戊醇各抽提一次，收集上清液加入
6、 RNase，37温育 60 min，再次用酚和氯仿/异戊醇各抽提，加入二倍无水乙醇沉淀，收集沉淀使用 700 mL/L 乙醇洗涤后干燥，使用 100 L TE 缓冲液溶解备用. 1.2.2 引物的设计根据 GenBank 发表的 CAV 基因序列设计扩增引物. 正向引物 5CGG CCG GCG TGG GAT GAA CGA TCT CCA AGA AGA TAC3 , 反向引物 5CAA GCT TCA GTC TTA TAC GCC TTC TTG CGG TTC3 . 粗斜体表示在正向引物和反向引物的 5端加入的 Nae I 和 Hind III 酶切位点，在正向引物和反向引物中分别
7、加入了 CG 和 C 保护碱基. 为了作 Apoptin 同相关蛋白的融合表达在反向引物 3端删除了终止子.1.2.3PCR 反应将上述目的基因进行 PCR 扩增，反应参数为：94 5 min 预变性, 94 60 s, 60 60 s, 72 90 s,循环 30 次后,72延长 5 min；PCR 产物的鉴定与回收及同线性载体 pGEMT 连接、受体菌的转化按常规分子生物学方法进行.1.2.4 阳性重组子的筛选与鉴定转化菌涂在含氨苄青霉素的加入 X gal 和IPGT 的 LB 平板上，挑取白色菌落，扩增后提取质粒，EcoR I 酶切后，琼脂糖凝胶电泳.1.2.5 序列比较分析选取阳性重组
8、克隆，由上海基康公司帮助测定插入片段序列. 插入片段同 CAV Apoptin 基因序列的一致性和编码蛋白质的分析使用DNAsis 2.5 软件完成.2 结果2.1PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增产物(366 bp)与目的片断相吻合（图 1）.2.2 重组质粒 pGEMT/Apoptin 的酶切鉴定重组质粒 pGEMT/Apoptin 经EcoR酶切琼脂糖凝胶电泳得到 2659 bp 和约 400 bp(393 bp)的两片段, 后者与目的片断大小一致(图 2). 2.3 重组 pGEMT/Apoptin 质粒中的 Apoptin 基因测序对获得的重组质粒进行 DNA 序列测定，
9、测定的结果表明插入片段与设计片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位.2.4 克隆 Apoptin 编码基因分析同 GenBank AF 313470 比较，本研究克隆的 CAV Apoptin 基因序列有 6 个核酸变异；同文献报道的 Apoptin 基因序列AY171617 一致.3 讨论Apoptin 是 CAV 的 VP3 蛋白基因编码的一种蛋白质，这种蛋白能特异性地诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，因此人们也称其为凋亡素-Apoptin,其发生作用不依赖 p53 基因，也不能被 Bcl2 过表达所抑制，有可能成为研究肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤药物很有用的一个靶分子.为了证实克隆的基因是否为 Ap
10、optin 基因,将其与 GenBank 数据库中相关基因进行比较,发现与 GenBank 数据库中登录的 46 株 CAV 的 VP3 基因的同源性至少为 98%，证实了克隆的 DNA 片段确为 Apoptin 基因. 同时将克隆的 VP3 基因ORF 推导得到的蛋白质一级结构与 GenBank 数据库中相关蛋白质进行比较，发现与 GenBank 数据库中收录的 29 株 CAV 的凋亡素氨基酸序列的同源性至少为82%. CAV 是一种比较保守的病毒5,目前仅发现一种血清型. 凋亡素分子的118 位氨基酸,所有报道的序列中几乎一半为 Cys,一半为 Arg. 实验证明,这一变化对凋亡素活性影
11、响似乎比较大,当这个位点的 Arg 变成 Cys 时,CAV 在传代细胞中的传代效率降低,而且将降低凋亡素的核定位能力,表现为存留在胞质中的凋亡素量将超过细胞核的量,进而将降低其诱导细胞凋亡活性. 我们克隆的VP3 基因编码的蛋白质是 118 Arg，因此可能具有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的活性. 凋亡素可能是通过一种与大多数功能蛋白质不同的作用机制来发挥其诱发肿瘤细胞发生凋亡作用的,凋亡素在发挥功能时可能并不以单体的形式存在,而是与其它成分结合,或与自身成分形成异源或同源多聚体来发挥其功能. Leliveld 等6将麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein, MBP)与凋亡素
12、分子连接,构建了一个可溶性的重组凋亡素蛋白融合体(MBPApoptin), 经反复试验证明 MBPApoptin 是一个由 3040 个亚基组成的稳定、均一在体内有活性的球形多聚体复合物；Zhang 等7通过显微注射手段将 MBPApoptin 分别注射到肿瘤细胞和正常细胞中,结果证实 MBPApoptin 在肿瘤细胞中具有显着的效价和特异性,而在正常细胞中细胞抗原表位被保护,MBPApoptin 汇集成高级聚集体,最终在细胞质中被蛋白酶降解而消失8. 由于 VP3 基因编码的凋亡素蛋白 Apoptin 具有很高选择性，这些特性进一步增强了凋亡素作为抗肿瘤药物的安全性. 从而有望解决肿瘤治疗中
13、高效性和特异性难于统一及易产生耐药性等难题. Apoptin 将是一种非常有前景的抗肿瘤制剂,它的开发利用必将会产生巨大的经济效益和社会效益.【参考文献】1 DanenVan Oorschot AA, van Der Eb AJ, Noteborn MH. The chicken anemia virusderived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosis in human tumor cellsJ. J Virol, 2000, 74(15): 7072-7078.2 Phenix
14、 KV, Meehan BM, Todd D, et al. Transcriptional analysis and genome expression of chicken anemia virusJ. J Gen Virol, 1994, 75(Pt 4): 905-909.3 Noteborn MH, Todd D, Verschueren CA, et al. A single chicken anemia virus protein induces apoptosis J. J Virol, 1994, 68(1): 346-351.4 DanenVan Oorschot AA,
15、Zhang YH, Leliveld SR, et al. Importance of nuclear localization of apoptin for tumorspecific induction of apoptosis J. J Biol Chem,2003,278(30):27729-27736.5 Zhang YH, Kooistra K, Pietersen A, et al. Activation of the tumorspecific death effector apoptin and its kinase by an Nterminal determinant o
16、f simian virus 40 large Tantigen J. J Virol, 2004, 78(18): 9965-9976.6 Leliveld SR, Dame RT, Mommaas MA. Apoptin protein multimers form distinct higherorder nucleoprotein complexes with DNAJ. Nucleic Acids Res, 2003,31(16):4805-4813.7 Zhang YH, Leliveld SR, Kooistra K, et al. Recombinant Apoptin multimers kill tumor cells but nontoxic and epitope
