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1、生 物 化 学,蛋 白 质,蛋白质的组成单位-氨基酸,二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构,蛋白质的一级结构,蛋白质的高级结构,蛋白质的理化性质和分离纯化技术,一、蛋白质的基本结构单位氨基酸,氨基酸(amino acid，aa)是蛋白质多肽链的基本结构单位，或称构件分子、构造单元（building block）。,蛋白质是成百上千个氨基酸分子以肽键相连，组成的长链分子（多肽链）。, 结构通式： ( 脯氨酸除外),aa,（一）常见氨基酸（20种）的结构及分类,(兼性离子形式),（中性分子形式）, 分类,一氨基一羧基 aa ：Gly, Ala, Val, Leu, Ile,含羟基 aa
2、 ：Ser, Thr,含硫 aa ：Cys, Met,含酰胺基 aa ： Asn, Gln,一氨基二羧基 aa (酸性 aa )：Asp, Glu,二氨基一羧基 aa(碱性 aa )： Lys, Arg,-,根据R基化学结构和极性分类,黑色：非极性R基氨基酸 绿色：极性R基氨基酸, 一氨基一羧基氨基酸,脂肪族氨基酸,（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）,羟基氨基酸,（丝氨酸、苏氨酸）,含硫氨基酸,（半胱氨酸、甲硫氨酸）, 二氨基一羧基氨基酸,（赖氨酸、精氨酸）,芳香族氨基酸,（ 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）,杂环族氨基酸,（组氨酸、脯氨酸）,（二）氨基酸的物理性质,都为白色晶体，不同氨基
3、酸结晶形状不同。 熔点很高，一般在200以上。 溶解度：大多数氨基酸都溶于水。Pro溶解度最大，其次为lys, Arg。胱氨酸和Tyr的溶解度较小。 氨基酸由于具有不对称碳原子，所以具有旋光性。,Tyr、Phe和Trp在近紫外区(220-300nm）有光吸收。 蛋白质 max = 280nm,氨基酸的溶解度,指出在正丁醇：醋酸：水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的迁移率： (1) Ile, Lys (2) Ala, Val, Leu (3) Pro, Val (4) Tyr, Ala, His,答：Rf： IleLys Leu Val Ala Val Pro Tyr Ala His,
4、氨基酸在晶体和水中主要以兼性离子存在。,（三）氨基酸的酸碱性质,氨基酸的两性解离,氨基酸是一类两性电解质，它既起酸（质子供体）的作用，又起碱（质子受体）的作用。,中性氨基酸的解离（以Gly为例）,注：K1 和K2 分别为-COOH 和 -NH3+的解离常数,Handerson-Hasselbalch公式,pH= pKa,pH- pKa=1,pH- pKa= -1,判断在任何pH条件下氨基酸各种基团的带电状态。,His 在pH7处有显著的缓冲能力,酸性氨基酸的解离 （Glu为例）,碱性氨基酸的解离 （His为例）,中性氨基酸的解离 （Gly为例）,pH=pI,pH pI,pH pI,电场中,净电
5、荷,+,0,-,不移动,移向正极,移向负极,氨基酸的等电点（isoelectric point, pI）, 在一定pH范围内，pH离pI 越远，氨基酸所带净电荷越大；,利用各种aa的pI不同，可通过电泳法、离子交换层析法进行分离。,调节溶液pH值，使氨基酸处于兼性离子状态，此时氨基酸所带正负电荷数相等，即净电荷为0，在电场中既不向阳极又不向阴极移动，这时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。,定义,pI为兼性离子两侧相应解离基团pK 的算数平均值。,与2，4-二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB） 的反应,弱碱中,DNP-氨基酸（黄色）,Sanger 试剂,此反应是Sanger法鉴定多肽或蛋白质N末端
6、氨基酸的依据。,(四) 氨基酸的化学反应, -NH2参加的反应,与苯异硫氰酸酯（PITC）反应,此反应是Edman法鉴定多肽或蛋白质N末端氨基酸的依据，在aa 序列分析方面占有重要地位。,PTC - aa,-氨基、-羧基共同参加的反应,紫色物质,注意： 脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质。,水合茚三酮,此反应用于定性、定量鉴定氨基酸。,茚三酮反应,成肽反应,肽键,4. 侧链R基参加的反应,氨基酸R基上的功能团也能发生化学反应。,功能团： 羟基（Ser, Thr） 巯基(Cys) 苯基 （Tyr, Trp） 酚基(Tyr) 吲哚基（Trp） 咪唑基(His) 胍基 （Arg） 甲硫基(Me
7、t) 非-NH2(Lys) 非-COOH(Asp, Glu),巯基易被空气或其它氧化剂氧化,胱氨酸,注意：二硫键可被氧化剂和还原剂打开,磺基丙氨酸,巯基乙醇 二硫苏糖醇（DTT）,二、蛋白质的一级结构,氨基末端 （N末端）,羧基末端 （C末端）,一级结构定义：,蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和连接方式。,氨基酸残基,1. 肽的结构通式,例：胰岛素的一级结构,英 Sanger 等，1953,Frederick Sanger,2. 肽键,C-N键具有部分双键性质,肽键一般为反式构型,肽平面,The trans and cis isomers of a peptide bond involving t
8、he amino nitrogen of proline. Over 99.95% of the peptide bonds between amino acid residues other than Pro are in the trans configuration.,3. 肽的物理和化学性质,物理性质,酸碱性质,化学反应,茚三酮反应、双缩脲反应,主要取决于游离末端的-NH2和-COOH及R基上可解离基团。,短肽为晶体，熔点很高。 在水溶液中以兼性离子形式存在。 具旋光性。,例：试判断Gly-Glu-Lys-Ala 在pH6.0时的带电状态。,答： -NH2 -COOH -NH2 -CO
9、OH,pH6.0 + - + -,所以，在pH6.0时，此四肽所带静电荷为“0”,胰蛋白酶： R1= Lys, Arg R2Pro,麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）： R1= Phe, Trp, Tyr R2Pro,胃蛋白酶：R1, R2 =Phe, Trp, Tyr , Leu等 R1Pro,嗜热菌蛋白酶：R2=Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Tyr, Met R2Pro,Gly,肽链内切酶,4. 肽链的断裂酶解法和化学裂解法,酶解法,肽链外切酶,CNBr：,羟胺(NH2OH)： 断裂Asn-Gly之间的肽键,化学裂解法,R1= Met, 生成肽酰高丝氨酸內酯,部分裂解Asn-Le
10、u 和Asn-Ala之间的肽键,三、蛋白质的高级结构,维持蛋白质高级结构的作用力,主要是较弱的相互作用，即非共价键或次级键。,包括： 氢键、 范德华力、 疏水相互作用、 盐键（离子键）,二硫键在维持蛋白质构象中也发挥重要作用。,可在多肽主链的羰基氧和酰胺氢之间、侧链与侧链、侧链与介质水之间等处形成。,氢键（hydrogen bond）,Some hydrogen bonds of biological importance., 包括三种较弱的作用力: 定向效应：极性分子(或基团)之间 诱导效应：极性和非极性分子(或基团)之间 分散效应：非极性分子(或基团)之间, 范德华距离（接触距离，cont
11、act distance）,范德华引力只有在两个非键合原子处于一定距离才能达到最大，这个距离称为范德华距离。等于两个原子的范德华半径之和。,范德华力很弱，但具有加合性。,范德华力（van der Waals force）,疏水基团或疏水侧链出于避开水的需要而被迫接近，这种现象称为疏水相互作用。,定义:,变性剂（尿素、非极性溶剂、去污剂等）可破坏疏水相互作用。,疏水相互作用（hydrophobic interaction）,F = (Q1Q2)/(R2) Q1，Q2: 电荷电量 ：介质的介电常数 R: 电荷质点间的距离,定义: 正、负电荷之间的一种静电作用。,生理pH条件下，酸性aa带负电荷，碱
12、性aa带正电荷。在分子的疏水内部，带相反电荷的侧链可形成盐键。,盐键: 又称离子键（ionic interactions）,对蛋白质的三级结构起稳定作用。,二硫键(disulfide bridge),(一)蛋白质的二级结构(seconary structure),-螺旋（ -helix ） -折叠（ -pleated sheet） -转角（ -turn） -凸起 ( -bulge ) 无规卷曲（random coil）,定义：指多肽链借助H键折叠盘绕成沿一维方向具有周期性结构的构象。,常见类型：,Although helices （螺旋）are not uncommon in manmade
13、architecture, there are a common structure theme in biological macromolecules protein, nucleic acids, and even polysaccharides（多糖）.,-螺旋（- helix）,-螺旋的结构要点：,1）多肽主链沿中心轴盘绕成右手或左手螺旋； 2）每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm，每个氨基酸残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm；螺旋直径0.5nm; 3） -螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧； 4）相邻螺旋间形成氢键，氢键几乎与螺旋的长轴平行，是由肽键上酰胺氢与其前面N端
14、第四个残基上羰基氧之间形成。,3.613-螺旋,影响-螺旋形成的因素,R基的电荷性质：同种电荷可产生静电斥力。例：多聚Lys(pH7)。,R基的结构： 例：Pro、Hyp可中断-螺旋。,R基的大小：R基大，空间位阻大。例:多聚Ile, -折叠片（ -pleated sheet）, -折叠股,1）肽链主链取锯齿状折叠构象。 2）两条或多条多肽链之间侧向聚集在一起，相邻多肽链羰基氧和酰胺氢之间形成氢键，氢键与肽链的长轴几乎成直角。 3）侧链R基交替分布于片层平面两侧。 4）肽链的走向可以是平行的，也可以是反平行的。, -折叠结构要点：,平行,反平行,-转角（ - turn）,The Structu
15、res of two kinds of - turns.,含有4个氨基酸残基。 第一个残基的羰基氧和第四个残基的酰胺氢之间形成氢键。 Gly 和Pro 常在- turn中出现。,-转角结构要点：,-转角可改变肽链走向。, -凸起（ -bugle）,大多数作为反平行折叠中的一种不规则情况。 可认为是折叠股中额外插入一个残基。,无规卷曲（random coil）,多具有明确、稳定的结构。 常构成酶的活性部位和蛋白质的特异功能部位。,钙结合蛋白中的 E-F hand 结构,（二） 超二级结构,蛋白质中，由若干相邻的二级结构单元（如-螺旋、-折叠、 - 转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体，以充当三级结构的构件，称为超二级结构。,三种基本组合形式：、 、 。,定义,2-4股右手 -螺旋相互缠绕形成左手超螺旋,（三）结构域（structure domain）,定义：对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种独立的折叠单位称为结构域。,一般含100-200个氨基酸残基。,例：肌红蛋白（153aa）,例：己糖激酶（约1000aa）2个结构域,结构域存在的优越性：,结构角度： 一条长的多肽链先分别折叠成几个相对独立的区域，再缔合成三级
