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1、第六章 质 粒 (plasmid),质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。,a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体） b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed circular DNA，简称cccDNA)， c、分子大小范围从l kb左右到1000 kb。 自20世纪80年代中期以来，在链霉菌、酵母、丝状真菌等微生物中都发现了线状DNA质粒，甚至还有RNA质粒。,质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。 如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞
2、在有相应药物或化学毒物的环境中生存。 质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。,在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，以质粒为载体在原核生物和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各个领域中得到广泛应用。 因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。,第一节 质粒的发现和命名,大肠杆菌的F因子是第一个被发现(1946年)的细菌质粒，它的
3、发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。 日本学者(1957年)报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。 70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。,一、质粒的发现,二、质粒的命名原则,质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。 最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如F因子(fert
4、ility factor，致育因子)、R质粒(resistance factor，抗性质粒)和Col质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒)等。 随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。直至1976年Novick等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。,其规则是： 质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。 编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pUC18和pUC19等。,第二节
5、质粒的遗传特征,一、 质粒的大小和拷贝数,质粒的大小：以分子质量MD或碱基对数kb表示，1MD的双链DNA=1.65kb。质粒的大小一般在1-200kb，最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤菌质粒pRm141a)。 质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。 质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。,质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid）和松弛型质粒（Relaxed plasmid）。 质粒在细胞内
6、复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称为严谨型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。 如F质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严格控制，属于严谨型质粒或低拷贝质粒。,另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。 分子量小的CoLEl质粒，每个细胞中有10-100个拷贝，它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。 含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的ColEl质粒可持续复制1015小时，直到每一个细胞中含有1 0003 000个质粒。基因工程研究中
7、所用的载体质粒大多数是这一类型的质粒。 控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相互作用的结果。,质粒大小和类型,二、 质粒的复制,复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。 复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，至少需要有一个复制起点，即ori位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。,几种常见质粒载体所携带的复制子,质粒的复制主要是通过型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以型复制为主。在型复制中，有单向复制和双向复制两种类型。 革兰氏阴性细菌中多数质粒是以型方式复制，R1、R100等是单向复
8、制，F、R6k等是双向复制类型。,1. 质粒复制的方式,质粒滚环复制示意图,质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，而复制所需要的其他蛋白，如DNA聚合酶、引物酶、连接酶、RNA-H酶、旋转酶(gyrase)和拓扑异构酶I、DnaB和DnaC等都是利用寄主的复制酶体系。,在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。,复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DN
9、A的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。,2. 复制起点(ori)区的功能,将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。,质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒的寄主范围通常是由ori区决定的。有些质粒如ColEl类型的质粒，包括pBR322、pET和pUC具有较窄的寄主范围，这些质粒只在E.col
10、i及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌(Klebsiella)中复制。,相反，RP4、RK2和RSFl010及从G+细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。,三、质粒复制的调控,质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，但二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的质粒，其复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负调控因子可以是蛋白质、RNA或DNA重复序列。,目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型： 抑制物-靶位调控（inhibitor-target regulation） 重
11、复子-竞争结合调控（iteron-binding regulation）,1. 抑制物-靶位调控,特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制的起始。 目标RNA是质粒DNA复制的引物或用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。 属于这一类复制调控的质粒有ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、CloDF13、R1等。,1）ColE1质粒的复制调控,ColE1为6.6kb的小质粒，拷贝数1020。其复制不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚合酶I和, DNA依赖的RNA聚合酶、核糖核
12、酸酶H (RNase H), DNA促旋酶和拓扑异构酶I。,ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点oriV开始，并单向进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNA，以及另一种负调控因子Rop蛋白，都是由ColE1 DNA转录产生的。,RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RNaseH酶所切割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。 RNA前体的合成起始于其复制起点上游555bp处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的5端折叠成复杂
13、的二级结构，从而使RNA产生一个富G环，后者与位于模板链复制起点上游20个核苷酸处的质粒DNA富C区正好匹配。随后，该RNA转录产物由RNaseH加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内5个A序列中。所得的555个核苷酸的成熟RNA II被DNA聚合酶I用作引物启动前导链的合成。,质粒DNA的复制过程,RNA是复制的负调节物 RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。 colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦DNA合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。 质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-R
14、NA II杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的RNA II间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。 这一平衡的改变主要由RNA来控制，RNA是由RNA基因的反义链编码的108个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生RNA II前体结合的三叶草结构，从而阻止后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构。,ColE1质粒复制起点结构,与RNA I的配对有可能引起引物RNA 二级结构的改变，从而阻止了3-OH 的产生（ RNaseH 不能切割）。,ROM/ROP蛋白对RNA负调节活性的调控 由质粒编码的一种被称为ROM(RNA modulator)或ROP(re
15、pressor of primer)的蛋白质可提高RNA与RNA结合的效率。ROM蛋白通过促进RNA和RNA杂交体的形成，增强RNA的负调节作用。 ROM是含有63个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于colE1复制起点下游400个核苷酸处的一个基因所编码。该二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个螺旋，因而此二聚体是由4个螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。 ROM蛋白与RNA和RNA具有相似的亲和力。它促使这两种RNA分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定的结构。,rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级。例 如，rom /rop基因的缺失可使较早期组建的载体pB
16、R322在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从1520个增至500个以上，在rom/rop基因中插入一段外源DNA片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制。,2）R1质粒的复制调控,R1质粒是IncF类型的代表质粒，其复制调控也是在RNA和蛋白质的作用下进行的，但RNA是间接调控的。 质粒复制起始所必需的RepA蛋白能在两个启动子的作用下转录。质粒刚进入细胞尚无CopB时，RepA在自身启动子下迅速转录；当达到适当的拷贝数时，PrepA启动子被CopB阻遏，RepA只能从PcopB转录。 copA自身启动子带动下从repA基因的互补链进行转录，因此其RNA与repA的翻译起始区重叠但转录方向相反，二者之间形成双链结构，被染色体编码的切割双链RNA的RNase降解。,2. 重复子-竞争结合调控,F、P1、R6k、RK2、RP4和pSC101等质粒是通过RepA进行复制调控的，它们在复制起始位点（ori）和复制基因（rep）附近存在多个17-22bp的DNA短片段，这些短片段被叫做重复子（iteron），含有
