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1、菊花的组织培养,大多绿色开花植物都是靠种子繁殖。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？,扦插,嫁接,压条,茎的营养繁殖方式,指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞和原生质体，并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。,组织培养,（1）基础知识,细胞离体,必要条件：,一定的营养物质、激素和其他外界条件,原理:,细胞的全能性,即已分化的细胞，仍具有发育形成完整个体的潜能。,原理：,定义：,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因,高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种
2、遗传性所需要的遗传物质,已分化的植物细胞，仍具有全能性,实例,受精卵 生殖细胞 体细胞,全能性的比较:,体细胞 生殖细胞 受精卵,分化程度低的细胞 分化程度高的细胞,植物细胞 动物细胞,细胞的分化,概念：,在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,结果：,形成不同的细胞和组织,原因：,基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果,细胞分化是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度。,特点：,（2）稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的,（3）全能性：已分化的细胞，仍具有发育的 潜能,（1）持久性：是一种持久性的变化，它发生在生
3、物体的整个生命过程中.,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,胚状体或丛芽,植物体,植物组织培养的基本过程,脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤)培养时,已停止分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特性的细胞。在植物中, 去分化细胞成为薄壁细胞, 称为愈伤组织,外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官,外植体：,脱分化：,再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽,形成完整植株,这一过程叫作再分化。,愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡
4、化的、成无定形状态的薄壁细胞,再分化：,愈伤组织：,菠萝的愈伤组织,愈伤组织,过程:,离体组织或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,植物细胞培养,不需要光,需要光,（二）影响植物组织培养的因素,1.不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。因此，植物材料的选择直接关系到实验的成败。对于同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。,外植体的年龄：幼嫩的植物组织 外植体的大小：大小适中 外植体所在的部位：茎尖
5、，根尖等 外植体的外观形态：表面相对光滑，容易消毒；,2.离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的一种培养基是MS培养基。 MS固体培养基成分及比例,A、大量元素: N、P、K、Ca、Mg、S等,氮:常用的是硝态氮（如硝酸钾）和铵态氮（如硫酸铵），MS培养基即含硝态氮又含铵态氮,植物组织从培养基中吸收NO3-或NH4+后，经过一系列的反应转化成氨基酸，进而合成蛋白质，成为植物体的主要组成部分,大量元素,微量元素，有机物，植物激素；,MS培养基主要成分包括：,磷：常由磷酸盐提供，是植物必需元素之一。磷参与植物生命过程中的核酸合成、蛋白质合成、光合作用、
6、细胞呼吸以及能量的储存、转化与释放等重要生化过程，因此，植物组织培养中需要大量的磷,钾：影响植物组织培养中酶的活性和方向，决定新陈代谢的方向，对分化有一定的促进作用,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等,铁：用量较多的微量元素，对植物组织叶绿素的合成和延长生长起重要作用,铜：促进离体根生长作用,钼：合成活跃的硝酸还原酶，固氮酶的组成部分，防止叶绿素被破坏,硼：与糖的运输、蛋白质的合成有关,C、有机物:如氨基酸、烟酸、肌醇、维生素，蔗糖等,此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物体的光能自养,在培养过程中，是脱分化、再分化的过
7、程，随着芽和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一个个体的演变过程,形成一个完整植株的能力（形态建成）。,思考：高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？,思考：培养过程中为什么需要进行光照？,常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素类：,赤霉酸（GA3）,D 植物激素的影响,植物激素浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，会影响实验结果。,植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分
8、裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响,（4）除了上述因素外，PH、温度、光照等条件也很重要。不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将PH值控制在5.8左右，温度控制在18-22，并且每日用日光灯照射12h。,讨论：1、你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,微量元素和大量元素提供植物细胞
9、生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。 微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,阅读课文，思考以下问题,2、你认为组织培养过程中，成功的关键有哪些？这些步骤的适宜条件是什么？,组织的脱分化及愈伤组织的再分化。,植物组织培养过程中，影响植物细胞脱分化、再分化的最重要因素是植物激素，细胞分裂素与生长素之间的浓度比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。,生长素/细胞分裂素,高 有利于根的分
10、化、抑制芽的形成 低 有利于芽的分化、抑制根的形成,同常规的无性繁殖方法相比，组织培养快速繁殖法主要具有以下优点： （1）快速。采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株，但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株。 （2）周年生产。花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生产。而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长季节进行繁殖。,组织培养与常规繁殖相比优点众多,（3）经济效益高。花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如按每株1元计算，每年产值上百万元。 （4）
11、以组织培养繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。所以使用这项技术可让优良的品种不断地延续。,组织培养与常规繁殖相比优点众多,2、培育无病毒植株（作物脱毒）,4、转基因植物的培育，基因工程中亦需用到植物组织培养的方法。,植物组织培养的应用：,3、制备人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题,1、植物快速繁殖,人 工 种 子,二、实验操作,制备MS固体培养基,外植体消毒,接种,培养,栽培,移栽,冲洗70%酒精无菌水冲洗氯化汞无菌水冲洗至少三次之上,二、实验操作,（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4保存配制好的培养基母液来制备。,1、配制
12、各种母液,为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配制成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高10100倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释。,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存。,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液。,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。,2、配制培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml。, 配制培养液,配制1LMS培养基，先将称好的琼脂加800ml蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g，取配制好的大量元素、微
13、量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml。, 调pH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素。,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起 进行高压蒸汽灭菌。,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干表面的水分。,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分
14、数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液，用无菌滤纸吸干表面的水分。,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟。,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,超净工作台的紫外灯照射消毒,3、材料的切取和接种,将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，
15、以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种68块外植体。接种后，将封口膜重新扎好。,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。,（四）培养,1、愈伤组织的培养,首次培养愈伤组织时，在无光条件下愈伤组织
16、长的更快。,2、愈伤组织的继代培养,培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。,3、试管苗的培养,当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养。,思考： 你打算做几组重复？ 你打算设置对照实验吗？,观察记录,试管苗,（四）培养,1、愈伤组织的培养,从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。,继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为11.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养。,2、愈伤组织的
