医学论文-趋化因子 CCL5 在类风湿关节炎患者滑液炎性细胞中的表达作者：刘宁涛，杨明辉，袁国华，魏 锦【摘要】 目的 探讨趋化因子 CCL5 (RANTES) 在类风湿关节炎（RA）的产生来源方法 用酶联免疫吸附法(ELISA)测定 28 例 RA 患者血清滑液中 CCL5水平，并对患者外周血白细胞和滑液炎性细胞体外产生 CCL5 进行研究结果 RA 患者血清和滑液 CCL5 水平均明显高于 OA 患者，RA 血清 CCL5 水平与关节肿胀指数、ESR、CRP 呈正相关RA 患者滑液炎性细胞体外产生 CCL5 水平较外周血白细胞高结论 血清 CCL5 水平与 RA 的活动性病变相关，RA 患者滑液炎性细胞是 CCL5 产生的主要来源关键词】 关节炎；类风湿；趋化因子；CCL5/RANTESProduction of CC chemokine CCL5 in synovial fluid inflammatory cells from patients with rheumatoid arthritis【Abstract】 Objective To determine the CC chemokine CCL5 (RANTES) level in serum and synovial fluid (SF) from patients with rheumatoid arthritis (RA)，and the expression of CCL5 in synovial fluid inflammatory cells.Methods CCL5 in serum and SF was quantified by ELISA in 28 RA patients and 21 OA patients. The production of CCL5 by SF inflammatory cells in vitro was also determined ，and compared with that by peripheral white blood cells.Results Serum CCL5 level in RA was higher than that in OA， moreover the concentration of CCL5 in SF was greater than in serum in RA. Serum CCL5 level correlated significantly with joint swelling index， ESR and CRP. Higher production of CCL5 was found in SF inflammatory cells from RA as compared with SF inflammatory cells from OA， and peripheral white blood cells from RA.Conclusion The increased level of CCL5 in RA， as well as the correlation of serum CCL5 with clinical and laboratory parameters of RA， indicate that CCL5 play an important role in RA. The increased production CCL5 by SF inflammatory cells suggests that those cells are main source of CCL5 secretion in RA. 【Key words】 arthritis rheumatoid chemokine CCL5类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎性关节炎，其病理特点为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出，及由此导致滑膜增生、血管翳形成，最终造成关节软骨破坏。
近期的研究显示，趋化因子（chemokine）在 RA 的炎性细胞关节浸润中起着极为重要的作用［1］现已发现 CC 亚族趋化因子受体5（CCR5）在 RA 关节浸润的炎性细胞中表达增高［2］，提示 RA 患者病变关节内 CCR5 的配体产生增多，选择性地趋化 CCR5 阳性白细胞亚群进入炎性关节部位本文通过采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定 RA 患者血液和滑液中 CCR5 配体CCL5 （又称调节活化的正常 T 细胞表达和分泌的因子(Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted，RANTES)）水平，并对 RA 患者外周血白细胞、滑液炎性细胞产生 CCL5 进行体外研究，以探讨CCL5 与 RA 的相关性，及其在 RA 患者的产生来源1 资料与方法1.1 一般资料 在本院就诊 RA 患者 28 例，男 5 例，女 23 例，年龄21～67 岁，平均年龄 38 岁，病程 6 个月～19 年，平均 7.8 年所有病人均符合美国风湿病学会 1987 年的 RA 诊断标准［3］，且病情处于活动期。
病人取空腹外周血，分离血清后置-20℃冰箱保存备用对 28 例患者中 11 例有膝关节积液的患者，在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，1000r/min，离心10min，取上清液置-20℃冰箱保存备用，沉淀用无菌 PBS 洗 3 次后，收集滑液中炎性细胞，同时收集并记录 RA 的临床资料，包括晨僵时间、握力、关节肿胀指数、关节压痛指数、关节 X 线病变程度、血沉、C 反应蛋白（CRP）和类风湿因子（RF）等实验室检查结果另选骨关节炎（OA）患者 21 例作为对照，其中男 7 例，女 14 例，年龄36～78 岁，平均年龄 45.2 岁，病程 1.2～15 年，平均 9.6 年对并发膝关节积液的 6 例 OA 患者，同时行膝关节穿刺，抽取关节液分离上清和细胞 1.2 CCL5 测定 CCL5 测定采用 ELISA 方法，CCL5 定量测定试剂盒（美国R＆D 公司生产）测定敏感度为 3.1pg/ml，操作按试剂盒说明书进行1.3 外周血白细胞和滑液炎性细胞体外产生 CCL5 的研究 对抽取关节液的 11 例 RA 和 6 例 OA 患者，另取外周抗凝血 10ml，离心去血浆后加 2 倍体积冷无菌 0.2%氯化钠溶液，振荡混匀 10s 后迅速加入等体积无菌 1.6%氯化钠溶液，在 4℃，1000r/min，离心 5min，去上清，重复裂解红细胞 1～2 次，用无菌冷PBS 洗 2 次后，加 2ml RPMI1640 培养液（含 10%小牛血清，100U/ml 青霉素和100μg/ml 链霉素）悬浮沉淀细胞，混匀后取 10μl 行台盼兰染色，活细胞计数。
收集到的外周血白细胞和滑液炎性细胞用上述培养液稀释成 105/ml，按每孔 0.5ml 接种于 24 孔培养板，置含 5%CO2 孵育箱中，于 37℃培养 48h，收集上清，按上述 ELISA 测定 CCL5 1.4 统计学处理 两组间计数资料用 t 检验，血清 CCL5 水平与临床及实验室指标的相关性分析采用直线相关回归分析2 结果2.1 血清和关节液 CCL5 测定结果 RA 和 OA 患者血清和关节液 CCL5 的测定结果见图 1对照 RA 患者血清 CCL5 水平与临床和实验室指标分析结果显示：血清 CCL5 水平与关节肿胀指数（ r=0.3229， P＜0.05），ESR（ r=0.4001， P＜0.05）和 CRP（ r=0.3735 ， P＜0.01）呈显着正相关（图2，图 3，图 4），而与晨僵、握力、关节疼痛指数及 RF 相关性不明显图 1 血清和关节液 CCL5 测定结果图 2 RA 患者血清 CCL5 水平与关节肿胀指数相关性分析结果 图 3 RA 患者血清 CCL5 水平与 ESR 相关性分析结果图 4 RA 患者血清 CCL5 水平与 CRP 相关性分析结果2.2 外周血白细胞和滑液炎性细胞体外分泌 CCL5 的检测结果 上述结果显示，RA 患者血清及滑液中 CCL5 水平增高，为探讨 CCL5 产生来源，本文对 RA患者外周血白细胞和滑液炎性细胞产生 CCL5 的情况进行观察，结果显示：滑液炎性细胞产生 CCL5 较 RA 外周血白细胞和 OA 滑液炎性细胞产生 CCL5 高，而 RA外周血白细胞产生 CCL5 与 OA 外周血白细胞无差异（图 5）。
图 5 培养液 CCL5 测定结果3 讨论本文通过 ELISA 方法检测 RA 患者血清及滑液的 CCL5 水平，并与 OA 患者对照，结果发现 RA 患者血清和滑液中的 CCL5 水平均明显高于 OA 患者且 RA 患者血清 CCL5 水平与患者的关节肿胀指数、ESR 及 CRP 呈现显着正相关，提示CCL5 参与 RA 的病变活动过程CCL5 主要由 T 淋巴细胞产生，但最近的研究表明，大多数细胞都可表达CCL5，尤其在致炎细胞因子如 IL-1β 和 TNF-α 存在的情况下在 RA 患者，我们观察到滑液 CCL5 水平显着高于血清，提示病变关节部位是 CCL5 产生的主要来源对 RA 患者外周血白细胞和滑液炎性细胞体外产生 CCL5 的情况分析结果显示， RA 患者滑液炎性白细胞产生的 CCL5 的水平明显高于 OA 患者滑液炎性细胞和 RA 患者外周血白细胞产生的 CCL5 的水平尽管 Robinson 等［4］观察到 CCL5 mRNA 在 RA 患者的外周血 T 细胞中表达增高，但本文未观察到 RA 患者外周血白细胞体外产生 CCL5 与 OA 患者有任何差异，此可能与 RA 患者外周血非T 细胞 CCL5 mRNA 表达下调［4］，因而使全血细胞产生 CCL5 水平无明显变化有关。
Robinson 等［4］对 14 例 RA 患者滑液炎性细胞中的 T 细胞和非 T 细胞表达 CCL5 mRNA 进行对照分析，结果显示所有患者滑液 T 细胞表达 CCL5 mRNA增高，而仅有 1 例患者的滑液非 T 细胞 CCL5 mRNA 表达增高Hosaka 等［5］对 CCL5 mRNA 在 RA 患者滑液单核细胞和正常人外周血单核细胞中的表达进行了比较，结果发现二者无差异，说明滑液中 T 细胞是滑液炎性细胞产生 CCL5 的主要来源OA 患者滑液中虽有多量炎性细胞，但其滑液 CCL5 水平并无明显升高，且滑液炎性细胞体外产生 CCL5 的水平与外周血白细胞产生 CCL5 的水平比较差异也无显着性，此可能与 OA 患者滑液炎性细胞以单核为主，而 T 细胞极少有关另一方面，CCL5 的表达受到其它细胞因子的调节，致炎细胞因子 IL-1β 和TNF-α 可诱导和刺激大多数细胞表达 CCL5而 RA 患者滑液中含有较高浓度的IL-1β 和 TNF-α［6］，这也可能是 RA 炎性细胞产生 CCL5 增高的原因之一对 RA 患者滑膜组织进行免疫组化染色显示，滑膜浸润炎性细胞，间质细胞及滑膜衬细胞均呈现较强的 CCL5 免疫染色阳性反应，而在 OA 滑膜组织中仅有少许血管周围炎性细胞染色阳性。
说明 RA 滑膜组织在产生 CCL5 中起重要作用Volin［7］和 Konig［8］等分别采用双重免疫染色和 mRNA 原位杂交技术检测CCL5 在 RA 滑膜炎性细胞中的表达，他们发现表达 CCL5 的阳性细胞主要为 CD68阳性巨噬细胞和 CD3 阳性 T 细胞Robinson 等［4］通过分离 RA 滑膜组织 T 细胞，对其表达 CCL5 mRNA 的情况进行研究，结果也证实 RA 患者滑膜 T 细胞CCL5。