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1、医学论文-间期双色双融合荧光原位杂交监测慢性髓系白血病异基因造血干细胞移植后 bcr/abl 融合基因作者：钱思轩，李建勇，张闰，洪鸣，仇海荣，李丽，徐卫，盛瑞兰，吴汉新【摘要】 本研究探讨 bcr/abl 双色双融合荧光原位杂交（DD-FISH）的敏感性及临床应用价值。对 19 例慢性髓细胞白血病（CML）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后微小残留病灶（MRD）用 DD-FISH 进行监测，同时与常规细胞遗传学（CC）、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较。样本取自骨髓，少数来源于骨髓片或外周血。结果表明：14 例 CML 患者在 Allo-HSCT 后 CC 显示持续正
2、常供者核型，RT-PCR 转为阴性，移植 2 月后均为完全供者嵌合（DC），DD-FISH 检测结果持续为阴性，平均随访 11.25 月，MRD 无增加。1 例 CC 及 RT-PCR 阴性，而性染色体 FISH 为混合嵌合，DD-FISH 阳性，监测无 MRD 增加，临床未治疗，疾病稳定。3 例骨髓复发患者的 DD-FISH 及性染色体 FISH 均提示MRD 明显增加，RT-PCR 转为阳性，却只有 1 例 CC 异常，供者淋巴细胞输注（DLI）及甲磺酸伊马替尼治疗后均为 DC，DD-FISH 阴性，RT-PCR 阴性。1 例骨活检证实髓外复发患者骨髓或外周血样本的 DD-FISH、CC
3、及 PCR 均阴性，供受者完全嵌合。结论：间期双色双融合 FISH 可应用于 CML 异基因造血干细胞移植后 MRD 的监测，其操作简易快速，灵敏度高，且骨髓或外周血均可采用。动态监测能及时发现扩大的白血病细胞克隆。 【关键词】 荧光原位杂交Monitoring of bcr/abl Fusion Gene by Interphase-Dual-Color and Dual-Fusion Fluorescence in situ Hybridization in CML after Allo-HSCTAbstract This study was aimed to investigate th
4、e sensitivity and clinical application value of interphase-dual-color and dual-fusion fluorescence in situ hybridization (DD-FISH). The minimal residual disease (MRD) in 19 patients with chronic myelogenous leukemia (CML) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) was detec
5、ted by DD-FISH，and the detected results were compared with those of conventional cytogenetics (CC) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The samples were collected from bone marrow or peripheral blood or smears of bone marrow. The results indicated that 14 out of 19 patients a
6、chieved and maintained continuous complete molecular remission after transplantation. In these patients，CC assay displayed normal donor karyotype，result of RT-PCR was negative，complete donor chimerism was detected after 2 months of transplantation，result of DD-FISH was negative，average time of the f
7、ollow-up survey was 11.25 months，MRD did not increase. Results of CC and RT-PCR in 1 patient showed negative，while FISH of sex chromosome showed mixed chimerism，result of DD-FISH was positive，MRD did not increase，no therapy was given for this patiant，clinical state of patient was stable. Three patie
8、nts with hematological relapse demonstrated obvious increase of MRD detected by DD-FISH and sex FISH，result of RT-PCR was found positive in them，but the abnormal result of CC was observed only in 1 patient. After donor lymphocyte infusion and imatinib mesylate treatment，these 3 patients achieved cyt
9、ogenetic remission again，results of DD-FISH，CC and PCR were negative in them. DD-FISH，CC and PCR in bone marrow and peripheral blood from one patient with extramedullary relapse revealed negative results，and the complete chimerism was found in this patient. It is concluded that interphase-dual-color
10、 and dual-fusion fluores- cence in situ hybridization is a more reliably sensitive and practicable method for monitoring MRD in patients with CMLafter allo-HSCT，and can be used in detection of chromosome sample and blood or bone marrow smears. Dynamic detection of bcr/abl fusion gene level by FISH m
11、ay predict disease changes and guide individual therapy.Key words FISH; DD-FISH，CML，allo-HSCT; bcr/abl fusion gene; MRD异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前治愈慢性髓细胞白血病（CML）的有效方法，Ph 染色体和 bcr/abl 融合基因是 CML 的特征性标志，应用常规细胞遗传学（CC）及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测 Ph 染色体和bcr/abl 融合基因已成为临床确诊 CML 的重要依据。allo-HSCT 后的有效监测关系到能否早期、准确判断肿瘤负
12、荷并及时给予相应治疗。近年来荧光原位杂交（FISH）技术因其简便、快速及灵敏等优势逐渐引起人们的重视。我们采用双色双融合荧光原位杂交（dual-color and dual-fusion FISH，DD-FISH）动态检测 19 例 CML 移植后的 bcr/abl 变化，同时与移植后嵌合状态、CC 和 RT-PCR的检测结果进行比较。材料和方法病例19 例 CML 系我院 2002 年 6 月-2005 年 5 月就诊并接受 allo-HSCT 的患者，CML 的诊断及分期标准参照张之南等主编的血液病诊断及疗效标准（第二版）。男 9 例，女 10 例，年龄 16-58 岁（中位年龄 39 岁
13、），慢性期 14 例，加速期 1 例，急变期 4 例，其中 3 例转变为急性粒细胞白血病，1 例转变为急性淋巴细胞白血病。移植时期及方式15 例 CML 患者在确诊后 1 年内进行 allo-HSCT，2 例分别在确诊后 18 月、28 月进行移植，2 例 CML 的病程超过 5 年。3 例转变为急性粒细胞白血病患者于 allo-HSCT 前服用甲磺酸伊马替尼（格列卫）600 mg/day 1-2 月。HLA 全相合移植 13 例，其中 2 例为非亲缘性；HLA 半相合移植 6 例。外周血移植 13 例，骨髓+外周血混合移植 2 例，骨髓移植 2 例，非清髓移植为 2 例。供受者性别相同者 1
14、0 例，性别不同者 9 例。19 例患者输入供者单个核细胞平均5.68108/kg，CD34 阳性细胞平均为 4.96106/kg。预处理方案半相合移植预处理方案为阿糖胞苷+环磷酰胺（CTX）+全身照射（TBI）；全相合移植为 CTX+TBI；非清髓移植则为福达华+TBI。移植后每 1-3 月进行骨髓常规检查、常规细胞遗传学检测、性染色体分析（供受者性别不同者）、短片段串联重复（short tandem repeats，STR）分析（性别相同者）及 RT-PCR和 FISH 检测 bcr/abl 融合基因。染色体核型分析所有的骨髓细胞进行直接法及短期培养法制备染色体标本，采用 R 显带技术进行
15、核型分析。核型异常按国际细胞遗传学命名标准（ISCN 1995）进行核型分析。性染色体双色间期 FISH 检测X、Y 染色体着丝粒特异性 DNA 探针及方法见文献1。每份间期核标本计数 1 000 个细胞，并记录杂交信号。绿色荧光信号（G）为 X，橘红色荧光信号（O）为 Y，根据患者核型为 XX 或 XY 的细胞百分率大于对照组的(X 埂?SD），即确定有无供体源的植入克隆或患者的残存克隆。双色双融合间期 FISH 检测探针购自美国 Vysis 公司，BCR 探针用 SpectrumGreen 荧光素标记，ABL 探针用 Spectrum Orange 荧光素标记。具体方法见文献2。每份间期核
16、标本计数 500-1 000 个细胞，并记录杂交信号。正常间期核细胞（G1）期将显示 2O2G随机分散的 4 个杂交信号。2 个绿色信号（G）为 22 号染色体的 bcr 基因所发出的荧光。2 个橘红色信号（O）为 9 号染色体的 abl 基因所发出的荧光。阳性细胞：间期核细胞将显示 1O1G2F 杂交信号。1G 为未发生易位的 22 号染色体上的 bcr 基因发出的荧光；1O 为未发生易位的 9 号染色体上的 abl 基因发出的荧光；1 个红绿融合信号（F）为融合基因所发出的荧光，叠加为黄色。RT-PCR 检测分离单个核细胞，提取总 RNA，进行 cDNA 合成及 PCR 扩增，PCR 引物序列为 bcr 引物 5 -CTCCAGA CTGTCCACAGCATTCCG-3，abl 引物 3 -AGACT GAAACTCGGAGTCCCAGAC -5 。2-MG 上游引物：5 -ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3，下游引物：5 -ATCTT
