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1、药学论文-间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究作者：杨思远，赁可，石应康，陈焕文，蒙炜【摘要】 目的： 为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源，探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs） 的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法: 利用淋巴细胞分离液分离出 MSCs,并体外扩增, 激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达, 以含血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化, 观察细胞形态的变化，检测内皮细胞特异性标志物的表达。结果: MSCs 在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示 CD44、CD90 表达阳性, CD3
2、1、CD45 为阴性, 分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征，并表达内皮细胞特异性标志物 CD31。结论: 骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。 【关键词】 骨髓； 干细胞移植； 大鼠 Spragua-Dawley； 间充质干细胞； 诱导分化； 内皮细胞Abstract Objective: To explore methods of separating and culturing mesenchymal stem cells （MSCs） of rats in vitro and to study the differentiation capability of bone ma
3、rrow MSCs into endothelial cells, so as to provide new source of seed cells for tissue engineering. Methods: MSCs were separated from bone marrow with density gradient centrifugation and wall sticking screening,and amplified in vitro. The surface antigens of MSCs were evaluated with confocal laser s
4、canning microscope （CLSM）.The passage cells were induced by differentiation induation media containing VEGF and bFGF to differentiate into endothelial cells. The morphological changes of differentiated cells were observed, and their specific indicator of endothelial cells was detected. Results: Afte
5、r MSCs being propagated and amplified in vitro, CD44 and CD90 were positively expressed in them, while expression of CD31 or CD45 was negative. The differentiated cells demonstrated the character of endothelial cells under phase contrast microscope.The expression of endothelial cell specific indicat
6、or, CD31, was detected at the same time. Conclusion: Bone marrow mesenchymal stem cells can be induced into endothelial cell line in vitro.Key words bone marrow； stem cell transplantation; rats,Sprague-Dawley; mesenchymal cell； induced differentiation； endothelial cell在治疗严重慢性缺血性疾病过程中，目前临床常规治疗方法常常无能为
7、力，不能很好地解除患者的痛苦。自 1999 年以来，有学者提出了治疗性血管新生（therapeutic angiogenesis）的概念，即将外源性血管新生诱导因子转入缺血组织中促进其血管新生和侧支血管形成，包括血管生成（angiogenesis）和血管发生（vasculogenesis）1。目前，治疗性血管新生已经发展成为一种治疗缺血性疾病的新方法，其中干细胞扮演了重要的角色。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）自 1966 年 Friedenstein2，3等人发现以来，多年研究结果表明，MSCs 在体外能自我复制、多系分化，具有强大的增殖能力，可分化
8、为骨、软骨、脂肪、韧带等多种间叶组织，可进行相应的组织修复。但目前关于 MSCs 是否能分化为成熟内皮细胞，研究尚不多见。故拟通过体外培养成年大鼠 MSCs，并将其向血管内皮细胞方向诱导，使所得细胞具有内皮细胞特性，旨在为临床上骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性疾病和将来血管组织工程所需种子细胞来源提供新的实验依据。1 材料和方法1.1 材料 SD 大鼠（清洁级，四川大学华西医学中心实验动物中心提供，雌性，约150 g）；胎牛血清（FCS，Gibco 公司），胰蛋白酶（Gibco 公司），血管内皮细胞生长因子（VEGF，invitrogen 公司），碱性成纤维生长因子（bFGF, R&D公司）；F
9、ITC 标记 CD44、CD90、CD31、CD45 抗大鼠单抗，因子山羊抗大鼠单抗（Santa Cruz 公司），即用型 SP 免疫组织化学检测试剂盒（SP-9003，北京中杉金桥生物公司）。1.2 大鼠 MSCs 的培养本研究采用梯度离心法加贴壁筛选法。取 SD 大鼠，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股、胫骨，暴露骨髓腔。用低糖无血清 DMEM 培养液冲出骨髓，离心后弃上清液，以无菌 PBS 液稀释。取离心管，分别加入等量 Percoll 分离液（=1.073 kg/L）和骨髓稀释液，离心 30 min（3 000 r/min）,仔细吸取白色单核细胞层，洗涤后用含 10%胎牛血清、100 U
10、/ml 青霉素、100 mg/L 链霉素的低糖 DMEM 培养基（pH=7.27.4）重悬，并调整细胞浓度至 4105/ml，接种于 250 ml 培养瓶，放入 37 、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养。7 d 后全量换液，后每 3 d 换液 1 次。至 1416 d 时，将融合生长约 80%的细胞以 0.25%胰酶-0.04%EDTA 消化，按 13 传代，定期取生长状态细胞进行倒置相差显微镜观察。1.3 大鼠 MSCs 表面抗原检测取生长已达到 90以上融合的 P3 代细胞，用 0.25%胰酶-0.04%EDTA 消化后，离心去上清液，无菌 PBS 液洗涤，4下 4%多聚甲醛固定 15 m
11、in 后，再用PBS 冲洗。分别加入 1100 稀释 FITC 标记的 CD44、CD90、CD31、CD45 单抗，于 37 下避光孵育 30 min，DAPI 复染细胞核，90%丙三醇封片，使用激光共聚焦显微镜观察。1.4 试验分组及诱导分化 将 P3 代大鼠 MSCs 消化后按 2.5105/ml 密度分为两组，即诱导组及对照组。诱导组换入含 10%FCS、10 g/L VEGF、4 g/L bFGF 的低糖 DMEM 培养基进行内皮方向诱导分化；对照组换入新的含 10% FCS 低糖 DMEM 培养基。两组均放入 37、5%CO2、饱和湿度孵箱静置培养，每 2 d 换液 1 次。1.5
12、 内皮细胞特性的鉴定两组均继续培养 14 d 后，取出细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，使用倒置荧光显微镜进行 CD31 免疫荧光检测，并计算其 CD31 阳性表达率。2 结果2.1 大鼠 MSCs 细胞形态学及表面抗原检测 原代培养 MSCs 3 d 后可见细胞贴壁，5 d 后出现细胞集落，细胞大小均一，呈长梭形或多角型；10 d 后细胞基本达到 90%以上融合，紧密排列成栅栏状，栅栏中心呈多层分布。MSCs 细胞 CD44、CD90 免疫荧光染色阳性（图 1）；CD31、CD45 均为阴性（未显示）。2.2 诱导分化后细胞形态学变化及相关抗原检测 诱导组细胞内皮方向诱导 14 d 后，见细
13、胞逐渐变大，形态由长梭形、多角形变为扁平多角形，并呈铺路石样排列（图 2a）,具有典型内皮细胞形态。诱导组细胞 CD31 免疫荧光染色均为阳性（图 2b），其阳性表达率95%；而对照组细胞形态无明显变化，仍为大小一致的长梭形或多角形，且 CD31 免疫荧光染色为阴性（结果未显示）。3 讨论在治疗严重缺血性血管疾病的过程中，治疗性血管生成是近年来研究的热点之一。血管生成的自然过程是多种细胞因子协调有序相互作用的复杂过程，而骨髓中干细胞能合成分泌多种促进血管生成的因子4，5。说明骨髓可成为在缺血条件下促进新生血管形成的有效材料。已有多项研究表明骨髓中存在的内皮祖细胞（endothelial pro
14、genitor cells, EPCs）可在一定环境下被诱导为成熟内皮细胞，并能增加缺血组织的新生毛细血管密度610。并且在临床实验中也取得良好效果11。这些都为缺血性疾病的治疗和血管组织工程种子细胞提供了新的途径。但目前国内外对于 EPCs 的分离鉴定尚无统一标准，且 EPCs 在体外扩增条件要求高，花费大，扩增数量有限，很难较好地满足当前缺血性疾病治疗和组织工程所需种子细胞的要求。故 EPCs 可能并不是最佳的选择。骨髓间充质干细胞是一族具有自我复制和多向分化潜能的细胞,在一定条件下可分化成骨、软骨、脂肪和内皮细胞等中、内、外胚层细胞。具有易于获得、能大量扩增等特点，这使得 MSCs 成为
15、种子细胞新的选择。本实验使用密度梯度离心法加贴壁培养法分离并纯化骨髓单核细胞，对其进行细胞形态学及表面抗原荧光检测，结果显示所得细胞呈长梭形，排列为栅栏状或螺旋状，且表达CD44、CD90，同时并不表达 CD31、CD45，符合 MSCs 表现。经过内皮诱导培养14 d 后，细胞形态发生较大变化，由长梭形变为扁平多角形，细胞呈铺路石样排列，且所得细胞高度表达 CD31，说明诱导后细胞获得了内皮细胞的特性，证明了 MSCs 在 VEGF 和 bFGF 诱导下可向内皮细胞方向分化。本研究使用密度梯度离心加贴壁筛选可获得 MSCs，体外诱导可获得内皮细胞，该法取材方便,操作相对简单、安全，为 MSC
16、s 移植治疗性血管新生提供实验依据。但本研究未涉及诱导后细胞生物学性质的研究，这有待在今后的研究中完善。4【参考文献】1Isner JM, Asahara T. Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularizationJ. J Clin Invest, 1999（9）:1231-1236.2Friedenstein, A J P-S I, Petrakova K V.Osteogenesis in transplants of bone marrow cellsJ. The Journal of Embryological Experimental Morphology,1966（16）:381-390.3Pittenger M F, Mackay AM,Beck
