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1、临床医学论文-自主细小病毒抗肿瘤作用研究进展【摘要】 自主细小病毒宿主广泛，对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，具有亲瘤性和溶瘤性，迄今未发现对人类有致病性，非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。全文综述细小病毒的结构和功能、抗肿瘤作用及机制、易感性、致病性等方面的研究进展。 【关键词】 自主细小病毒1 病毒抗肿瘤治疗概述一百多年以前人们开始利用各种野生型病毒能够溶解肿瘤的特性治疗癌症，但在上世纪 60 年代由于毒性问题此方法一度被放弃。DNA 重组技术的发展，使得人们可以通过基因操作来增强病毒的肿瘤特异性从而使得安全性大大提高，基因治疗一度成为人们战胜癌症的希望所在。从 1990 年到 2004
2、年间共有 1 020 项基因治疗临床实验，其中 675 项（66%）是治疗癌症，675 项中一部分基因治疗应用的是非溶细胞性病毒如逆转录病毒、腺病毒相关病毒、质粒 DNA、脂质体转染、基因枪等方法。另外一半以上是溶瘤病毒治疗，包括通过基因改造获得肿瘤选择性的腺病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒等三个 DNA 病毒以及 2个野生型肿瘤特异性的 RNA 病毒新城疫病毒和呼吸道肠道过滤性病毒1。其中中国上海三维公司研制的腺病毒 H101/ONYX-015 于 2005 年获得 SFDA 批准，成为第一个溶瘤病毒药物。以上恶性肿瘤的病毒治疗无外乎通过三种方式：一是病毒作为转基因载体转导治疗性基因，二是病毒直
3、接溶解肿瘤，三是结合病毒的溶瘤特性和转导的治疗性基因的特性进行溶瘤基因治疗2，3。病毒载体转基因治疗存在的载体系统转染效率低、目的基因表达量低等问题一直没有得到根本的解决，此外基因操作难、病毒滴度低、残存的野生型病毒感染静止细胞等问题也影响治疗效果1。因此，采用无需进行基因操作，又具有肿瘤特异性，对正常细胞无影响、无致病性、无毒、有效的病毒直接杀伤肿瘤将是最理想的方式。 在恶性肿瘤细胞内具有复制能力的溶瘤病毒除了以上提到的腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、呼吸道肠道过滤性病毒外，还有水泡性口膜炎病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、细小病毒等4。但腺病毒、单纯疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒会损伤
4、非转化细胞或诱导炎症反应，新城疫病毒 NDV PV701 有剂量依赖性的毒性。人们研究细小病毒的历史还不长，但已有的研究结果表明细小病毒是 DNA病毒中惟一没有致瘤成员的病毒。而且细小病毒只在肿瘤细胞内发挥毒性作用：即对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，而对正常细胞则无影响，具有亲瘤性和溶瘤性，不整合到宿主的染色体中，没有插入突变的风险，迄今未发现对人类有致病性，因此非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。2 细小病毒 H-1 的结构感染脊椎动物的细小病毒有腺病毒相关病毒（AAV，依赖病毒属，病毒复制需辅助病毒），自主细小病毒（细小病毒属如大鼠细小病毒 H-1、小鼠细小病毒 MVM 和红细胞病毒属人红
5、细胞细小病毒 B19 等）。细小病毒 H-1 的天然宿主为大鼠，与其它啮齿类细小病毒（如 MVM，Lu和大鼠病毒 RV）一样，H-1 可以在包括人类的多种细胞内复制。它的复制发生在细胞周期的 S 期，依赖宿主细胞的酶系，其复制循环包括吸附、进入、复制、组装和释放五个步骤。病毒的吸附和进入可发生在任何时候，但病毒基因的复制需要细胞周期 S 期特异的相关因子，并和细胞的增殖分化状态有关5。细小病毒 H-1 基因组有 2 个启动子，P4 和 P38。P4 指导病毒非结构蛋白NS1 和 NS2 的合成，P38 指导外膜蛋白 VP1 和 VP2 的合成。NS1 是一个多功能的蛋白，具有解旋酶、核酸内切酶
6、、ATP 酶、DNA-nicking 和序列特异性 DNA 结合活性，既可控制病毒 DNA 的复制和表达，还具有细胞毒性作用5。见图 1。3 细小病毒 H-1 的抗肿瘤活性H-1 不仅能抑制动物自发肿瘤的发生，也能抑制诱发肿瘤。众多的研究证明 H-1 对各种类型的肿瘤（肉瘤、癌、白血病），不同诱因（DNA 和 RNA 肿瘤病毒，化学致癌剂）以及人和动物（鼠、犬）的肿瘤均有抑制作用5。在体外的实验系统中，H-1 亦有明显的抗瘤活性，如转化的纤维母细胞和上皮细胞、人鼻咽癌细胞、人胃癌及肝癌细胞等对 H-1 均敏感6。但转化细胞对细小病毒的敏感性是不同的，与细胞类型以及转化诱导剂都有关系。H-1 以
7、及 RV、MPV-1、RPV-1 等啮齿类细小病毒对淋巴类组织表现很强的趋向性，提示这类病毒可用来治疗造血系统的肿瘤。体外实验也证实一些人白血病和淋巴瘤细胞系对 H-1 病毒非常敏感。大多数啮齿类细小病毒对内皮细胞来源的肿瘤也具有强趋向性，提示血管肿瘤和血管增生也可能成为 H-1 病毒治疗的靶子。H-1 病毒还可以体外感染和杀伤转化的人成纤维细胞和上皮细胞，在 SCID 小鼠体内抑制人Hela 移植瘤的生长7，对大鼠胶质瘤细胞系和短期培养的人原代恶性胶质瘤、神经胶质瘤细胞有很强的剂量依赖性的杀伤作用8，9。细小病毒的抗肿瘤活性一方面表现为直接的毒性作用，另一方面表现为免疫系统介导的抗肿瘤作用。
8、细小病毒的直接细胞毒性作用主要由病毒非结构蛋白 NS1 产生，NS2 可调节 NS1 的作用。体内试验表明在坏死的肿瘤组织周围有大量 NS1 表达。Geletneky K 等研究了 H-1 对恶性胶质瘤的毒性作用与病毒的复制和感染性病毒颗粒产生有关。Cornelis JJ 的研究表明，H-1 不经过完整的病毒复制周期也可产生细胞毒性作用， 证实 H-1 的抑癌作用不仅可以通过病毒在肿瘤细胞中的大量复制溶解肿瘤，还可以通过产生毒性 NS1 蛋白发挥作用10。用糖皮质激素诱导的启动子控制 NS1 基因在稳定转染细胞（SV40 转化的新生儿肾细胞系 NBE 和 c-Ha-ras 癌基因转化的大鼠成纤
9、维细胞系 FREJ4）内的表达，研究 MVMp（prototype strain of MVM）感染细胞后细胞周期的变化，发现 NS1 在细胞 S 期开始大量表达，干扰细胞 DNA 复制，细胞阻滞在 S/G2 期。NS1 的表达还诱导了细胞染色质内缺口的形成11。由于细胞周期停顿是 DNA损伤的一般表现，所以作者认为 NS1 是通过诱导细胞染色质的损伤而发挥增殖抑制作用的。但染色质缺口的形成到底是由 NS1 本身的内切酶活性引起的还是细胞内切酶活化引起的还不得而知。进一步的研究表明12，NS1 介导的细胞周期阻滞与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk，Cyclin A/Cdk 和 Cyclin E/
10、Cdk2 复合物)抑制剂 p21cip1 的蓄积有关，而 p21cip1 的转录激活物 p53 却没有蓄积。用 p53+/+和 p53-/-细胞的实验表明 p53 对 S 和 G2 期阻滞都发挥作用, 而 p21cip1-/-细胞的实验表明 p21cip1仅对 G2 期阻滞发挥作用。这说明 NS1 诱导的 p21cip1 通过抑制 cyclin A 依赖的激酶活性使细胞停止在 G2 期。由于蛋白磷酸化在调控一些重要蛋白的活性，如转录因子和细胞周期调控蛋白等起重要作用，因此 Anouja F 等研究了 NS1 蛋白对宿主细胞蛋白的合成和磷酸化的影响。结果发现 NS1 干扰 14kD、35kD、
11、50kD 蛋白的磷酸化，提示NS1 的毒性效应与细胞蛋白的磷酸化有关13。一些间接的实验证据表明细小病毒的抑瘤作用有免疫成分的参与5。例如，同时注射腹水细胞和 MVMp 的小鼠可产生长期的免疫力，对再次注射的肿瘤细胞产生免疫排斥现象，而小鼠本身没有 MVMp 慢性感染迹象，说明此免疫排斥不是体内病毒的作用。虽然免疫系统介导的抗瘤机制还不清楚，但可能的原因：一是感染病毒的细胞死亡后释放的病毒抗原被树突状细胞( DC )摄取，从而激发了抗病毒细胞毒性 T 淋巴细胞( CTL )介导的免疫反应，与肿瘤抗原产生了交叉反应；二是死亡的肿瘤细胞抗原被 DC 摄取，产生了抗肿瘤 CTL 反应；第三，病毒还可
12、能通过干扰细胞因子网络，提高炎症反应和/或免疫反应而对抗肿瘤。支持以上可能性的实验证据是：在接受 H-1 病毒感染后人肿瘤移植物消退的小鼠体内检测到活化的 NK 细胞浸润14。而且，用 RV 感染的大鼠体内一些具有免疫调节、抗肿瘤和抑制血管生成作用细胞因子表达增加。细胞因子表达谱的变化可能是病毒与肿瘤细胞和免疫细胞相互作用的直接或间接结果5。用 H-1（MOI=20）感染黑色素瘤细胞 SK29-MEL-1(HLA-A2+)和 SK29-MEL-1.22(HLA-A2)，培养 6 天，然后与正常血液分离的非成熟 DC (iDC)共培养 1天，对照为未处理的黑色素瘤细胞、冻融法处理（诱导坏死）的细
13、胞和 UV 照射的细胞(诱导凋亡)。结果 DC 对 H-1 感染的和 UV 照射的肿瘤细胞裂解物(tumor cell lysates，TCLs )的吞噬能力强于冻融处理的细胞。iDC 细胞与 H-1 感染的 TCLs 共培养后，出现 CD80、CD83、CD86 等活化 DC 标志。此外 H-1 感染的HLA-A2的 TCLs 与 DC 共培养后，可使 SK29 特异性的 CTL 及 A2+限制性 CTL 都释放 IFN-，而坏死和凋亡的 HLA-A2-TCLs 没有特异性 CTL 反应，不释放 IFN-。说明 H-1 诱导的 TCLs 可通过 DC 活化、提呈肿瘤特异性抗原(TAA)给肿瘤
14、特异性 CTLs，发挥抗肿瘤作用15。Raykov Z 等16向生长 B78 黑色素瘤、MAIDS 相关的淋巴瘤、H5V 血管肉瘤的 C57BL/6 小鼠、正常 B6 小鼠腹腔及肿瘤内注射 109PFU 的 MVMp 病毒，1 天后检测肿瘤、脑、胸腺、肺、肾、小肠、肝、脾、肿瘤引流淋巴结及远端淋巴结内病毒 NS1 转录物，腹腔注射各组没有大的差异，但瘤内注射组在肿瘤及其引流淋巴结内检测到病毒转录，血管肉瘤和黑色素瘤尤其明显，此后逐渐下降，2 周后已检测不到。说明病毒可能在转移到淋巴结的肿瘤细胞或固有淋巴细胞内表达。进一步分析表达 NS1 的淋巴细胞亚群为 CD11b(Mac1)+/CD11c+
15、(MDC，髓样树突状细胞)或 CD45B(B220)+(B1 淋巴细胞)细胞，MDC 和 B1 细胞 IP-10 表达显着升高，IFN- 没有变化，但体外 MVMp 可显着提高 LPS 诱导的 IFN- 表达。IP-10 是趋化因子，淋巴细胞的活化剂，因此间接的效应是激活其它免疫细胞并释放相应的细胞因子发挥作用。4 细小病毒 H-1 对肿瘤的易感性虽然 H-1 病毒的宿主广泛，但不同细胞对 H-1 的敏感性有差异。Cornelis JJ 等17的研究表明，成纤维细胞和上皮细胞对 H-1 感染的敏感性是不同的，该作者比较了细胞中病毒 mRNA 的表达情况，结果表明敏感性的差异是与病毒结构和非结构
16、蛋白的转录水平相关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞内的定位、病毒 mRNA 的稳定性、非结构蛋白 NS1 的磷酸化都没有关系。H-1 易感的角质细胞其中病毒 DNA 的复制扩增与 H-1 不敏感的细胞相比也没有变化。所以这几种细胞对 H-1 的易感性主要与病毒基因组的转录水平有关。Telerman A 等从 H-1 敏感的人 K562 白血病细胞系分离到 H-1 抵抗株 KS，发现 KS 细胞的恶性表型减弱，且抵抗 H-1 的杀伤18。细胞感染病毒 1 年以后，用 PCR 方法仍然能够在细胞内检测到病毒 DNA，而且其培养上清感染指示细胞NBE，用 H-1 病毒 DNA 特异性探针杂交，也能检测到杂交信号，说明 KS 细胞释放了感染性病毒颗粒。分析 KS 及亲本 K562 细胞 18 种与分化有关的表面抗原，未发现不同。两者的生长倍增时间、细胞周期分析都相似。但两者的转化和致瘤能力明显不同，在软琼脂上的克隆形
