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1、药学论文-紫外分光光度法测定鹰嘴豆和豆芽中异黄酮含量的研究作者：程珍 阿依古力阿不列孜 马庆玲 高艳华 阿吉艾克拜尔艾萨【摘要】 目的建立一种检测鹰嘴豆异黄酮含量的快速分析方法，并检测鹰嘴豆和豆芽中异黄酮的含量。方法采用紫外分光光度法，检测波长为 260.9 nm，测定鹰嘴豆及其豆芽中异黄酮的含量测定。结果鹰嘴豆芽素 A 在 230 g/ml范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系，以黄酮总含量测定结果重复性RSD=1.95%，加样回收率为 100.18%。结论为鹰嘴豆提取物及制品提供一种简单、可靠、有效的测定方法。 【关键词】 鹰嘴豆 豆芽 异黄酮 紫外分光光度鹰嘴豆是豆科鹰嘴豆属鹰嘴豆 Cice
2、r afiefinum L的成熟种子，为一年生栽培植物，维吾尔语称其为诺胡提(音译)，主要种植在新疆、甘肃等地区，是维吾尔族人常用的药食两用的食品，有治疗糖尿病、高脂血症、支气管炎、性欲降低等疾病的作用。有关鹰嘴豆中异黄酮的报道不多，谭永霞等1从鹰嘴豆中分离得到异黄酮，关于鹰嘴豆异黄酮的含量测定及其方法均未见报道。本研究用自制的鹰嘴豆芽素 A 为标准品，在紫外最大吸收峰 260.9 nm 处测定了鹰嘴豆和其豆芽异黄酮含量，豆芽中异黄酮含量达到 5.057%，并确定了鹰嘴豆异黄酮含量测定方法。1 材料与仪器鹰嘴豆为木垒县产的“Desi”品种，豆芽经常规发芽得到，鹰嘴豆豆芽素A 对照品为本实验室分
3、离制备；试剂均为分析纯。 SHIMADZU UV-2550 型分光光度计；戴安 P680 高效液相色谱仪；UVD170u 型紫外检测器；Chromeleon 型色谱工作站；超声波清洗器（KQ-250B 型）；电子天平（SEJ180-4 型）。2 方法2.1 样品液的制备精确称取 2.0 g 鹰嘴豆粉和干燥后的鹰嘴豆豆芽粉(过25 目筛)，每一样品平行作两份，溶于 20 ml 的甲醇中，采用超声波提取 3 次，功率为 59 kHz，温度为 25 ，提取时间为 45 min，过滤，合并滤液，测定吸收值，每一样品测 3 次，取 6 个测定的吸收值均值为该样品的吸收值。2.2 标准品的制备和标准溶液的
4、配制2.2.1 标准品的制备鹰嘴豆豆芽提取物经硅胶柱、SephadexLH20 层析后得到化合物，再经制备 HPLC 进一步纯化，归一法其纯度为 98.96%，经 1H-NMR，13C-NMR 结构鉴定：黄色针状结晶，mp 216217(CH3OH)。 H-NMR(DMSO-d6)6： 835(1H，s，H-2)，749(2H，d，J=84 Hz，H-2 ，6 )，699(2H，d，J=87 Hz，H-3 ，5 )，641(1H，d，J=21 Hz，H-8)，624(1H，d，J=18 Hz，H-6)，378(3H，s，OCH3)；13C-NMR(DMSO-d6)6：1544(C-2)，122
5、7(C-3)，1799(C-4)，1615(C-5)，987(C-6)，1639(C-7)，936(C-8)，1575(C-9)，1043(C-10)，1219(C-1 )，1300(C-2 )，1136(C-3 )，1590(C-4 )，1136(C-5 )，1300(C-6 )，550(OCH3)。以上数据与文献2一致，故鉴定化合物为鹰嘴豆芽素A(biochanin A)。HPLC 制备色谱条件：ODS-A 色谱柱（250 mm20 mm，5 m）；流动相MeOH-H2O（8020）；进样量 1 ml；流速 7 ml/min；检测波长 260 nm。色谱图见图 1。图 1 标准品鹰嘴豆芽素
6、 A 的 HPLC 图2.2.2 标准溶液的配置精确称取已纯化的鹰嘴豆芽素 A 标准品 5.0 mg，置于 25 ml 容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，浓度为 200 g/ml。 2.3 波长的选择分别取一定浓度的标准溶液和样品液，在波长为200400 nm 的紫外区范围进行扫描，测定参数为 Abs，中速，采样间隔为 1 nm，记录范围-1.6384.000，根据紫外吸收光谱图确定其测定波长。2.4 标准曲线的绘制精确吸取 0.10，0.20，0.40，0.50，1.00，1.50 ml标准品溶液分别置于 6 个 10 ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇作空白对照，在波长
7、最大吸收峰处测定吸光度，得到以鹰嘴豆芽素 A 溶液浓度C 为横坐标、吸光度值 A 为纵坐标的标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，可得标准曲线方程。3 结果3.1 检测波长的确定鹰嘴豆异黄酮结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系，对紫外光有较强的特征吸收，故选择紫外区进行波谱扫描。鹰嘴豆芽素 A 标准溶液的最大吸收波长在 260.9 nm 处，样品液的最大吸收波长也在 260 nm 处，两者的最大吸收波长基本没有偏差，故选择 260.9nm 处作为测定波长。见图2。图 2 鹰嘴豆异黄酮吸收曲线3.2 标准曲线方程在 260.9 nm 处测定一系列鹰嘴豆芽素 A 标准溶液的吸光度值，以吸光度 A 为纵
8、坐标，浓度 C 为横坐标，求得回归方程 Y=0.1218 0X+0.064 18，相关系数 r=0.999 5，鹰嘴豆芽素 A 在 2.0030.00 gml 范围呈良好线性关系。3.3 鹰嘴豆和其豆芽异黄酮的含量在紫外最大吸收峰260.9 nm 下，测的鹰嘴豆和豆芽的异黄酮含量，每个样品测 3 次，2 个平行样。测得结果：鹰嘴豆异黄酮含量为 0.016%；鹰嘴豆豆芽异黄酮含量为 5.057%。3.4 稳定性实验分别取一定量新鲜配制的标准溶液和样品溶液，在动力学窗口，吸收波长 260.9 nm 下测定其吸收值，观察其稳定性，每隔 15 min 取一测定值。结果放置 7 min 测得的吸光度值稳
9、定不变；将放置 7 min 测得的吸光度值作为 0 min，并每隔 30 min 测定 1 次，结果标准溶液在所试 3 h 内相对标准偏差 RSD=0.8，样品溶液在所试 3 h 内 RSD=1.3。实验表明，鹰嘴豆芽素A 标准品溶液和鹰嘴豆提取样品液在所试 3 h 内稳定。3.5 重复性实验将在一定工艺条件下所得的提取鹰嘴豆提取液随机取 6 份，作为样品溶液，分别测定吸光度值，根据标准曲线方程求得对应浓度，经统计学处理，其 RSD=1.95。实验结果表明，本方法的重复性较好。3.6 精密度实验在线性范围内，同一样品 6 次平行测定的相对标准偏差RSD 0.1。实验表明，该方法的精密度较高。3
10、.7 加样回收率实验精密吸取 0.8，1.0，1.4，1.6，2 ml 鹰嘴豆芽素 A标准溶液于 5 只 25 ml 容量瓶中，再分别精密加入样品溶液 5 ml，按测定程序进行测定，计算回收率。所得结果如表 1。5 个样品的回收率在 97.4 103.4之间，其平均加样回收率为 100.18，RSD 为 2.1。表 1 回收率实验结果4 讨论以鹰嘴豆芽素 A 为标准品，采用紫外分光光度法进行鹰嘴豆异黄酮含量的测定，具有方法简便、快速、准确、重复性好等特点，特别适于对提取分离工艺条件的实验研究，无需专用试剂即可测定提取效率、流出曲线等指标，还可考察工艺条件的优劣，故本方法可作为检测鹰嘴豆异黄酮含
11、量的一种有效手段。异黄酮类化合物是广泛存在于豆科植物中的一类生物活性物质，一直被人们用来治疗心血管系统疾病和糖尿病。研究表明，异黄酮具有抗氧化、抗溶血、通过降低血脂和血浆胆固醇来防治心血管疾病的作用，还具有雌性激素样作用，有利于骨质疏松症、更年期综合征、前列腺癌及乳腺癌的预防3。本文使用自外分光光度法测得鹰嘴豆中异黄酮含量是 0.016%，其豆芽异黄酮含量是5.057%。由结果可以看出鹰嘴豆胚芽中异黄酮的含量要远远高于鹰嘴豆中的异黄酮，几乎是鹰嘴豆中异黄酮的三百多倍。由此，可采用鹰嘴豆发芽这一简单前处理的方法富集鹰嘴豆中的异黄酮，从而有利于鹰嘴豆异黄酮产品的开发。【参考文献】1 谭永霞，孙玉华，陈若芸.鹰嘴豆化学成分研究J.中国药学杂志，2007，32（16）：1650.2 马 强，雷海民，周玉新，等. 红车轴草化学成分的研究J.中国药学杂志，2005，40（14）：1057.3 杜 宁，许 勇.异黄酮的医用价值J.中西医结合学报,2003,1(4): 296.
