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1、一、研究的目的及其意义一、研究的目的及其意义 1.意义：能源危机这个时代沉重不可避免的话题以及同样重要的环境污染问题需要更加重视。纤维 素乙醇作为新的清洁能源的一支,正在备受瞩目的开发研究之中。当前获得的纤维素酶的活性偏低, 满足不了工业化生产的要求。 虽然微生物可以直接降解天然的纤维素原料,但是,已知的纤维素酶却不 能直接高效的降解结晶纤维素。如何快速有效地获得高活性的纤维素酶及产酶菌株成为了研究的热 点之一。本实验利用刚果红脱色圈法,从多种含降解纤维素的自然环境中,得到高纤维素酶的细菌,进 一步进行紫外诱变处理,获得酶活显著提高且具有遗传稳定性的菌株,最后通过单因素优化实验,初步 确定较优
2、的培养条件。这对利用木质纤维素原料的发酵制备燃料乙醇,解决当今世界所面临的环境污 染、资源和能源危机等问题具有一定的现实意义。 2.目的 了解产纤维素酶微生物分离的基本原理和方法； 掌握筛选原则与操作方法； 掌握纤维素酶活力检测原理与方法； 掌握诱变育种原理与紫外诱变的操作方法； 掌握优化方法； 掌握发酵罐的基本操作； 了解正交分析方法。 二、二、国内外的研究现状和发展趋势国内外的研究现状和发展趋势 据估计,通过植物的光合作用,地球上每年合成的植物量约达 1.8*1011t,其中有一半是纤维素物 质1,3,我国每年农作物稻秆?产量达 6xl08t 之多,利用微生物产生的纤维素酶,将这些闲置的纤
3、维素资 源水解转化,则可以在能源、词料、食品、纺织、造纸等方面得以有效利用4,6,不仅可以减少因堆弃 和焚烧对环境带来的污染,还将带来的巨大的经济效益和社会价值。 能源危机和环境污染的凸显,使得可再生清洁能源之一的生物质乙醇的进一步研发迫在眉睫。虽 然国内外对于发酵工艺和代谢工程的研究较为广泛,但是目前取得的进展仍然存在较大的不足。一方 面,人类获得的纤维素酶酶活力偏低,且不能直接高效降解天然结晶的木质纤维素。另一方面,自然界 的大量微生物却可以直接快速的利用天然的木质纤维素来迅速繁衍。筛选并获得高活性的纤维素酶 及其菌种,对于纤维素乙醇的研究具有重要意义。 三、研究的主要任务三、研究的主要任
4、务 1.调查并充分查阅资料； 2.设计实验方案 ； 3.样品的采集与处理； 4.实验操作的准备； 5.详细的实验流程； 1 6. 实验结果处理及计算。 四、试验方案初步设计四、试验方案初步设计 本实验以产纤维素酶的菌种为研究对象，进行分离鉴定和培养条件的优化，以及对其所产的纤 维素酶进行酶活检测等。包括六个实验项目： （一）产纤维素酶菌种的分离； （二）产纤维素酶菌种 的筛选与保藏： （三）纤维素酶活力检测及酶学性质研究方法； （四）产纤维素酶菌种诱变育种条件 优化；五）产纤维素酶菌种产酶条件优化;（六）结果分析、正交设计及发酵罐放大培养条件研究。 五、研究方法及步骤五、研究方法及步骤 （一）
5、产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定 1.实验内容：筛选平板的制作取土样土样处理稀释涂布培养观察染色筛选。 2. 实验原理：本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤 维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长， 利用筛选培养基分离产纤维素酶的 微生物。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用 CMC-Na，分离出 能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。 3. 实验流程：土样采集实验器材灭菌无菌水的制备筛选培养基配制及倒平板土样预处 理及梯度稀释倒平板涂布培养、观察、记录。 （二）产纤维素酶菌种的筛选与保藏
6、1.实验内容：编号接种保藏刚果红染色洗脱比较挑选菌种转接保藏。 2. 实验原理：刚果红能和纤维素结合，纤维素酶能水解纤维素，从而使刚果红在产纤维素酶菌 株周围结合到纤维素而形成透明圈，从而选择目标菌落。利用微生物的纯培养以确定分离所 得的最佳产酶微生物，并进行保存与进一步研究。通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能； 通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。 3. 实验流程：编号（选择透明圈与菌落直径比值较大，分离效果较好）接种培养 （三）纤维素酶活力检测及酶学性质研究方法 1.实验内容：梯度标准 G 溶液DNS 显色540nm 分光光度计检测绘制标曲 发酵液与空白滤纸反应终止反应显色检测计算选择菌
7、种 菌种斜面接种保藏备用 2. 实验原理：本实验使用强碱终止分解反应，通过 DNS 法进行吸光度的测定。根据相应的标准 曲线，运用比色法可以推算出反应液中葡萄糖的生成量，进而推算出酶的活力。 3. 实验流程：制种子液制备纤维素酶原酶液纤维素酶的测定（按下表比例稀释成不同葡萄 糖浓度溶液显色反应）滤纸酶活性（FPA）测定菌种传代保藏 （四）产纤维素酶菌种诱变育种条件优化 1.实验内容：斜面菌种稀释涂布紫外诱变暗培养观察筛选 2. 实验原理：本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变 异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种。 3. 实验流程：斜面
8、菌种梯度稀释涂布紫外诱变暗培养刚果红平板染色菌种鉴定 （五）产纤维素酶菌种产酶条件优化 2 1.实验内容：改变碳源（氮源、无机离子、生长因子）的种类与用量培养检测分析确定 结果 2. 实验原理：以酶活为指标，通过单因子实验及正交实验，确定各因素对产酶影响的大小及最 佳发酵产酶条件。 3. 实验流程：菌种活化及摇瓶种子制作产酶培养基选择碳源的选择氮源的选择无机盐 的选择培养基优化产酶发酵条件选择发酵产酶的培养基初始 PH 选择发酵产酶的摇 床转速选择发酵产酶接种量的选择装液量对发酵产酶的影响发酵产酶的发酵时间选择 （六）结果分析、正交设计及发酵罐放大培养条件研究 1.实验内容：设计正交实验优化培
9、养基与培养条件 发酵管的消毒接种中间取样检测发酵结果观察 2. 实验原理：正交试验设计（orthogonal experimental design）是研究多因素多水平的又一种设 计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性 的点具备了“均匀分散，整齐可比”的特点，正交试验设计是分析因试设计的主要方法。是一 种高效率、快速、经济的实验设计方法。 3. 实验流程：因素水平的确定正交表的选择分析数据 3 参参考文献考文献 1 兰时乐,陈姻,李慧,等.产纤维素酶菌种 TP1202 的选育及产酶条件研究J.生物技术,2003,13(2): 12-13. 2 Claas
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