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1、药学论文-超声波法提取大黄胰蛋白酶抑制剂作者：杜旭东，刘同祥，张宗申，牛建昭，王继峰【摘要】 目的研究大黄中胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。方法 以提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，采用正交实验法对提取溶剂用量 (A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4 个因素进行优选研究，并以优选出的提取方案进行验证实验。结果因素 B，D 对提取效果有显着的影响，因素 C 影响不显着。结论 大黄中胰蛋白酶抑制活性成分有效部位的最佳提取工艺为 A3B1C3D2。 【关键词】 大黄； 超声提取； 胰蛋白酶抑制剂； 正交实验Abstract：ObjectiveTo optimize the ex
2、traction procedure for trypsin inhibitor from Rheum officinale BaillMethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter, we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors, including volume of extraction solution (A), temperature of extraction sol
3、ution (B), time of extraction (C) and extracting times(D), on the extraction of trypsin inhibitor, then after to examine the optimized procedure. ResultsFactor B and D performed significant effect on the extraction, and Factor C came next. ConclusionThe optimum extraction technology was A3B1C3D2 whe
4、n the inhibition ratio of trypsin activity was considered as preferential parameter.Key wordsRheum officinale Baill； Ultrasonic wave extraction； Trypsin inhibitor； Orthogonal design蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor, PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动、植物和微生物中。PI 在体内能与相应蛋白酶的活性中心结合，从而抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶，使体内蛋白酶抑制剂
5、与蛋白水解酶形成一个动态平衡，在一系列的生理代谢过程中起着调控作用，是生物体内免疫系统的重要组成部分1。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor, TI）具有重要的药用价值,对急性胰腺炎、肺气肿、休克、脑水肿和脑缺血等都有很好的临床治疗效果，还有研究表明其对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义2。在临床应用中，化学合成的蛋白酶抑制剂有着生物利用度低的缺点，以及不可避免地产生副作用和耐药性，且化学合成的 PI 生产成本高，价格昂贵。天然植物来源的蛋白酶抑制剂具有环境兼容性好、安全、开发成本低等优点，符合药物发展的趋势3。因此，从传统中药中筛选具有TI 活性成分的药有很广阔的应用前景和
6、市场价值。刘同祥等4的筛选试验结果表明中药大黄有很好的胰蛋白酶抑制活性。随着大黄药理和临床应用研究的深人 ，发现它具有抗肿瘤 、保肝利胆 、改善肾功能 、活血止血 、降血脂等多方面的作用。本实验以大黄 Rheum officinale Baill 为材料，对胰蛋白酶抑制剂的提取条件进行了研究。1 器材1.1 仪器可见光分光光度计(7202B 型 上海尤尼柯仪器有限公司) 、离心机（LD-4型 北京医用离心机厂）、精密 pH 计（PHS-3 型 上海雷磁仪器厂）、数显恒温水浴锅（HH-6 型 江苏金坛荣华仪器制造有限公司）、精密电子天平（FA2004N型 上海民桥）、超声波清洗器（KQ-500B
7、 型 昆山市超声仪器有限公司）。1.2 试剂胰蛋白酶( 北京麒麟宏伟公司) 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰 DL-精氨酸对硝基苯胺（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯。2 方法与结果2.1 大黄胰蛋白酶抑制剂的抑制率测定采用苯甲酰 DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法5：取胰蛋白酶液 1 ml，加药材提取液 1 ml 在 37水浴保温5 min，加入 BAPNA 溶液 5 ml，37水浴保温 10 min 后，立即加 1 ml 三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在 410 nm 波长条件下测定吸光
8、度。按下列公式计算样品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr)- (As-Abs)(Ar-Abr)100% 式中：i 抑制百分率，%Ar 标准溶液的吸光度Abr含标准溶液的空白对照液的吸光度As样品溶液的吸光度Abs含样品溶液的空白对照液的吸光度2.2 粗提溶剂的选择取磨碎生药 5 g，在 60下，分别用双蒸水及10%，30%，50%，70%，90%的乙醇作为提取溶剂进行实验，超声提取 2 h。结果如图 1 所示，随着乙醇浓度的增大，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率下降，双蒸水效果最好。2.3 各因素的最佳范围确定2.3.1 最适温度的确定根据上述结果，取磨碎的大黄 5g，加双蒸水 150 ml，
9、分别在 10，30，50，70，90条件下超声提取 2 h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率，结果表明在 4050范围内提取液对胰蛋白酶活性的抑制率最高。见图 2。2.3.2 最适体积的确定取磨碎的大黄 5 g，在 60下，分别按110，120，130，140（W/V）超声提取 2h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着体积比的增大提取液对胰蛋白酶活性的抑制率在上升。见图 3。2.3.3 最适提取时间的确定取磨碎的大黄 5 g，在 60下，按 130 体积比，分别超声提取 0.5，1.0，1.5，2.0 h，过滤离心后取
10、上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着时间的增加提取液对胰蛋白酶活性的抑制率增大，当达到 1.5 h 后增加的幅度开始下降。见图 4。2.3.4 最适 pH 值的确定取磨碎的大黄 5 g，在 60下，按 130 体积比，在 pH 为 3，5，7，9，11 的条件下超声提取 2 h，过滤离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果如图 5 所示，各个条件下变化幅度不大，在中性条件下提取液抑制效果最好。2.3.5 最适提取次数的确定取磨碎的大黄 5 g，在 60下，按 130 体积比，每次提取 2 h，分别提取 1 次，2 次，3 次，4 次后合并滤
11、液，离心后减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。结果表明，随着提取次数的增多，提取液对胰蛋白酶活性的抑制率上升。见图 6。2.4 各因素影响下的最优提取工艺的确定2.4.1 大黄胰蛋白酶抑制剂提取的正交实验设计根据溶剂选择实验结果，本实验采用双蒸水作为提取 TI 的溶剂。称取磨碎大黄 5 g，在平行操作条件下，选用 L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行 9 次实验，每次实验重复 3 次（正交因素水平见表 1）。表 1 因素水平（略）表2 L9(34)正交实验结果（略）表 3 正交实验的方差分析（略）2.4.2 结果与方差分析由 R 值可知, 各因素对试验结果
12、的影响次序为 BDCA。由 K 值可以得出当提取条件为 A3B1C3D2 时效果最好，即在 30 倍量水，45，1.5 h/次，提取2 次为最佳提取工艺。此工艺条件刚好为 7 号试验，所以不用再做验证实验，其抑制率为 79.4%，是所有实验中抑制率最高的。由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为 BDCA，其中因素 B 与 D 为高度显着，因素 C 对实验结果的影响较小,因素 A 没有统计学意义。3 讨论由单因素实验结果可知，在提取温度较低时，随着温度的升高提取液对胰蛋白酶抑制率呈上升趋势，但是当温度达到 50时抑制率开始下降，说明最佳的提取温度范围为 4050，但到 70时仍保持很高
13、的抑制率，说明 TI 耐高温性比较强；随着溶剂量的增大提取液对胰蛋白酶抑制活性升高，但随着提取溶剂量的增大会带来浓缩困难，从实验条件和生产成本考虑选用 30 倍体积（W/V）较合适；提取液的 pH 值对提取液的抑制率影响不大，但中性条件下提取效果较好一些，说明大黄 TI 易溶于中性溶剂中；提取液的抑制率随着提取时间呈正比，1.5 h 后增加的幅度开始下降，综合考虑选用 1.52.0 h 比较合适；提取次数越多提取的效果越好，但经过两次提取后抑制率的增加就不明显了，结合实际生产和效率提取 2 次是最合适的。本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化, 并按最佳工艺进行了验证实验, 结果证明用该
14、工艺作为大黄 TI 的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。但对大黄胰蛋白酶抑制剂的理化性质需要进一步研究。【参考文献】1Pandya MJ ,Smith DA ,Yarwood A ,et al .Complete amino acid sequences of two inhibitors from buckwheat seedJ. Phytochemistry ,1997 ,43：327.2文方德，傅家瑞.植物种子的蛋白酶抑制剂及其生理功能J植物生理学通讯，1997，33（1）：1.3蔡步林，李卓荣.人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂的研究开发与展望J.中国生化药物杂志，2005，26（3）：179.4刘同祥，牛建昭，杜旭东，等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选J.中国中药杂志，2007，32（7）：643.5Godbole SA , Krishna TG, Bhatia CR.Purification and characterization of protease inhibitors from piheon pea ( Cajanus cajan(L.) Millsp) seedsJ.J Sci Food Agric，1994，64：87.
