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1、 动物肝脏中提取DNA 【实验目的】 1.掌握肝脏DNA分离的原理及操作过程 2.掌握主要试剂的作用 3.熟悉DNA纯度及含量鉴定方法 【实验原理】 动物肝脏。小牛胸腺和鱼类精子含有较多的DNA，是提取DNA的良好材料。动植物的DNA室以核蛋白的形式存在于生物体中（主要在核内），DNA核蛋白（DNP)在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度很低，近视它在纯水中的1%。，而在1mol/L NaCl溶液中，其溶解度至少是纯水中的二倍。相反，核糖核蛋白（RNP）能在0.15mol/L NaCl溶液中溶解。利用这一性质，可使脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白分开。 制备过程中，当细胞破碎时，脱氧核糖核酸酶的
2、活性增加，DNA将遭受降解，为此在提取液中加入柠檬酸盐、EDTA 做抑制剂，并要求整个提取操作在 4以下进行，以减少酶对DNA的破坏。 分离得到的DNP，进一步用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，用含有异丙醇的氯仿除去变性蛋白，最后用95%的冷乙醇从溶液中把DNA沉淀出来。 DNA纯度可以通过A260/A280进行鉴定，而浓度可以用紫外吸收法、定磷法、二苯胺显色法测定。 【实验操作】 1取新鲜猪肝脏，除去血水和结缔组织，在冰浴上切成小块，称取10g，加入2倍体积（20ml） 0.15molL NaCl0.015molL枸橼酸钠缓冲溶液，于组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再以玻璃匀浆器23次使细胞
3、破碎，最后加缓冲液至50ml。 2.组织匀浆移入离心管内，浸入冰盐溶液中冷却，而后在4下6000rmin离心510min。弃上清（可用于制备RNA）。将沉淀用2倍体积的冷的上述缓冲液洗涤2次，洗涤时用匀浆器研磨洗涤，离心条件同上。 3将离心后所得沉淀物悬于 5 倍体积的 0.15molL NaCl0.1molL EDTA-Na2（pH8.0）溶液中，而后边搅拌边慢慢滴加5SDS溶液，直至SDS的最终浓度达到1%为止。然后加入固体NaCl，使其最终浓度达1mol/L。继续不断搅拌3045min，以确保NaCl 全部溶解，此时可见溶液由黏稠变稀薄。 4。将上述混合溶液倒入一个300ml磨口三角瓶里
4、，加入等体积的氯仿-异戊醇（20：1），振荡20min，室温3000r/min离心10min。由此可见，离心管中分为三层，上层水溶液，中层变性蛋白，下层氯仿-异成醇。振荡，离心取上清。如此重复直至中间蛋白层消失。5.最后一次离心后小心吸取上层水相，记录体积，放入小烧杯中，加入2倍体积预冷的 95乙醇。加入时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动。此时可见白色DNA显微逐渐缠于玻璃棒上，直至无纤维出现为止。 6.纯度鉴定：将所得DNA纤维用75%乙醇洗涤2次，置于干净试管中，加入0.15mol/L NaCl- 0.015mol/L 枸橼酸钠缓冲溶液 5ml，使其溶解。测 A2
5、60/A280，0.15mol/L NaCl-0.015mol/L枸橼酸钠缓冲溶液做空白。如果比值大于1.8说明含有RNA，如果比值小于1.8说明含有大奶：如果等于1.8说明DNA纯度较高。 7含量测定：所得DNA制品可用紫外吸收法、定磷法、二苯胺显色法测定DNA含量。 【试剂和材料】 1.材料：猪肝 2. 0.15mol/L NaCl-0.015mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH7.0）：称取8.77g NaCl和4.41g枸橼酸钠（Na3C6H5O72H2O），用蒸馏水溶解，以0.1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后定容至1000ml。 3.0.15molL NaCl0.15molL
6、 EDTA-Na2溶液（pH8.0）：称取8.77g NaCl和37.2g EDTA-Na2溶于800ml蒸馏水中，以2mol/L NaOH调至pH8.0，最后定容至1000ml。 4.5SDS溶液（W/V）：称取5g SDS，溶至100ml45%的乙醇中。 5.氯仿一异戊醇溶液：按氯仿：异戊醇=20：1(V/V)配制。 6.95乙醇溶液。 7.75乙醇溶液。 【器材】 剪刀及天平；刻度吸管；试管；三角瓶及烧杯；量筒（10ml）；组织捣碎机和玻璃匀浆器；离心机；紫光分光光度计。 【注意事项】 1.制备肝细胞匀浆时不要过度匀浆，以免DNA断裂。 2.加入氯仿一异戊醇后勿剧烈振荡，以免DNA纤维断裂。 3.有机溶剂对人体有害，操作时要注意。 4.为了尽量降低DNA酶的影响，提取过程应在冰浴上进行。
