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1、医学论文-急性颅脑外伤后局部脑组织热休克蛋白 70 的表达【摘要】 目的探讨人颅脑外伤后伤灶周围神经细胞中热休克蛋白 70(HSP70)的表达及其与损伤时间的关系。方法采用免疫组织化学技术检测 58 例颅脑外伤患者伤后 72 h 内局部脑损伤区神经细胞中 HSP70 表达。结果伤后 6 h HSP70 已出现阳性表达,24 h 达高峰,至 72 h 仍呈较高水平;GCS7 分组 HSP70 表达显着高于 GCS8 分组(P0.05),存活组表达显着高于 2周内死亡组(P0.05)。结论 HSP70 在急性颅脑损伤后不同程度表达增强,并具时相规律性。 【关键词】 脑损伤 热休克蛋白质 70 免疫
2、组织化学 人类自 20 世纪 80 年代以来,热休克蛋白 70(heat shock protein70, HSP70)作为维持机体自身稳定性的应激蛋白,日益受到人们注目。在创伤所致应激反应过程中 HSP70 的表达及其保护作用的研究方兴未艾。目前国内绝大多数研究仍然是建立在实验动物模型上12 。笔者采用免疫组织化学方法检测自 2001 年11 月2005 年 6 月 58 例不同程度急性颅脑外伤患者局部伤灶标本中脑神经细胞 HSP70 表达情况,探讨它们与损伤时间的关系。1 对象与方法1.1 对象随机选取急性颅脑外伤手术患者 58 例,男性 41 例,女性 17 例,年龄(45.112.3)
3、岁(1476 岁);其中合并颧骨骨折 6 例，下颌骨骨折 3 例，前臂骨折 2 例，肾挫伤 1 例。所有患者均无低血压休克史,无感染发热史。患者受伤部位均为额颞顶部,因严重挫裂伤和/或硬膜下血肿急诊行开颅手术。受伤至手术时间 372 h。按格拉斯哥昏迷评分法(GCS)分为7 分组(32 例)及8 分组(26 例)。存活 38 例(存活组),2 周内死亡 20 例(死亡组),死因为脑干功能衰竭。1.2 方法切取损伤区周边损伤脑组织少许(术前均征得患者家属同意,并签定知情同意书),室温下立即置于体积分数为 0.01 甲醛溶液中固定 24 h,常规石蜡包埋后制成 5 m 厚连续切片备用。另选非神经系
4、统疾病猝死 7 例(对照组),男性 5 例,女性 2 例,年龄(36.419.3)岁(1168 岁),标本取自额颞部。免疫组织化学染色采用链霉抗生物素蛋白 过氧化物酶联结法(SP 法),SP 试剂盒及一抗(鼠抗人)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.3 结果判定以细胞核和/或细胞质内棕褐色沉淀为阳性细胞。在显微镜下,随机计数 100 个神经细胞,以其中的阳性细胞数除以 100,得出 HSP70 阳性细胞百分率。多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS007 型,北京航空航天大学设备厂)对HSP70 阳性细胞进行计数,求出每平方微米(m2)单位面积中阳性细胞数。1.4 统计学处理数据以 xs
5、 表示。采用 SPSS 12.0 软件包进行统计分析,组间比较采用 Independentsampeles t test。2 结果对照组神经细胞中几乎未见 HSP70 阳性表达,脑外伤组伤灶周围神经细胞质或细胞核中均可见 HSP70 阳性表达(图 1)。A:对照组;B:脑外伤后 72 h.图 1 脑外伤后 72 h 神经细胞 HSP70 阳性表达(SP 法 100)Fig 1The expression of HSP70 in neural cells following traumatic brain injury脑外伤组不同时相 HSP70 阳性细胞百分率和单位面积中阳性细胞数均高于对照组
6、(P0.01);伤后 6 h 在伤灶周围神经细胞中 HSP70 表达已呈阳性,24 h 表达最多,随后逐渐降低,至 72 h 仍有较高水平表达;存活组表达明显高于死亡组(P0.05,表 1)。表 158 例脑外伤热休克蛋白 70 免疫组织化学染色比较与对照组比较,:P0.01;与死亡组比较:,:P0.05.3 讨论HSP70 是组织细胞在热环境中或应激条件下产生的一种相对分子质量约 70 kD 的蛋白质,具有高度保守性和诱导生成普遍性,能提高细胞对应激原的耐受性1。组织细胞在遭受应激刺激后,HSP 基因被变性蛋白激活,诱导产生一组应激蛋白。大多数生物细胞应激反应后 HSP70 出现显着改变,其
7、主要功能是促进新生多肽链的正确折叠,对分子重排、蛋白质解聚和新生多肽的跨膜运输也具有重要的辅助作用。HSP70 广泛存在于正常细胞和肿瘤细胞的细胞质、高尔基体、内质网、核及核仁中,起着多种分子伴侣的作用,参与多种细胞内蛋白的折叠、装配及转运,行使“看家”功能24 。脑挫伤后 HSP70 阳性细胞最早出现的时间各家报道不一。最早在伤后 30 min 脑挫伤灶周围即有 HSP70 的表达5;而 Truettner 等在液压冲击脑损伤模型中显示损伤灶及其周围细胞质中 4 h 开始出现 HSP70 mRNA6。Dutcher 等对创伤性脑损伤患者挫伤的脑皮质进行 Northern 及 Western
8、杂交分析,发现伤后46 h HSP70 mRNA 达到高峰,24 h 恢复正常;伤后 1220 h HSP70 蛋白达到高峰。免疫组织化学显示,伤后 12 h HSP70 在神经元内阳性表达2。笔者曾研究显示,伤后 6 h 内伤灶周围神经细胞中 HSP70 已呈阳性表达,其阳性细胞百分率和单位面积中阳性细胞数均显着高于尸检对照组(P0.01),24 h 阳性表达最多,与文献报道基本一致23; 随后 HSP70 表达逐渐降低,直至 72 h 仍有较高水平表达。以往文献报道均未涉及伤后 72 h 的表达情况47, 但本研究中伤后 72 h 与对照组比较差别有统计学意义(P0.01)。笔者推测可能原
9、因有三:与原发损伤后再缺血有关;神经细胞受损程度及耐受性不同;取自不同损伤区域神经元其表达不同。Gilby 等在大鼠实验研究中发现,HSP70 在受伤后神经细胞中存在分阶段表达的现象7。由于该时相组例数太少,无法更多了解损伤后 72 h HSP70表达情况;且缺乏伤后超早期(2 h)的标本,有待今后进一步研究。HSP70 在组织细胞损伤的过程中表达增强,对细胞具有保护作用,是内源性细胞保护因子,同时也能反映细胞损伤的程度。笔者研究证实,GCS7 分组的HSP70 表达明显地高于 GCS8 分组(P0.05)3,说明细胞损伤程度不同,应激反应强度也不一样,HSP70 蛋白表达随损伤的增加而表达增
10、强。存活组的 HSP70表达明显高于 2 周内死亡组(P0.05),说明损伤局部脑组织中 HSP70 表达是外伤后局部神经细胞反应性的一种表现,对受损神经细胞的功能修复和损伤程度的减轻可能具有一定的作用。但当神经元损伤超过其自身修复代偿能力时,其表达水平则随损伤程度的增加而减少,提示损伤可能非不可逆性。笔者认为,颅脑外伤后 HSP70 的表达是脑组织在基因水平的一种自身保护性机制,其表达水平在一定程度上可作为评估颅脑伤情的临床参考指标之一。【参考文献】1闫东明,张志强,宋来君,等. 右美沙芬治疗对兔急性脑外伤保护作用的研究J. 中华创伤杂志, 2002,18(10):596598.2Dutch
11、er S A,Underwood B D,Walker P D,et al. Patterns of heatshock protein 70 biosynthesis following human traumatic brain injuryJ. J Neurotrauma, 1998,15(6):411420.3陈峻严,黄金钟,黄种心,等. 颅脑外伤后局部脑组织 HSP70 基因的表达J. 中华创伤杂志, 2006,22(8):623624.4林章雅,康德智,连葆强,等. 高表达热休克蛋白 70 鼠脑胶质瘤细胞瘤苗的体内抗瘤作用J. 福建医科大学学报, 2005,39(4):373375
12、.5王慧君,饶广勋,朱少华,等. HSP70、NF 应用于脑挫伤时间推断的实验研究J. 法医学杂志, 2000,16(3):132134.6Truettner J S,Hu B,Alonso O F,et al. Subcellular stress response after traumatic brain injuryJ. J Neurotrauma,2007,24(4):599612.7Gilby K L,Armstrong J N,Currie R W,et al. The effects of hypoxiaischemia on expression of CFos, CJun and Hsp70 in the young rat hippocampusJ. Brain Res Mol Brain Res, 1997,48(1):8796.
