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1、医学论文-家兔肝抑素对大鼠肝癌的作用【摘要】 目的 研究肝抑素（HC）对大鼠实验性肝癌的治疗作用和作用环节。方法 采用二乙基亚硝胺(DEN)诱导法建立大鼠肝癌模型。观察大鼠肝脏的病理改变、肝表面癌结节数、肝重/体重。以甲胎蛋白（AFP）、-谷氨酰转肽酶（-GT）和碱性磷酸酶（ALP）作为观察指标。采用流式细胞仪检测肿瘤细胞的动力学变化。结果 大剂量 HC 的疗效优于阿霉素(ADM)，其作用环节是阻滞了 G0G1 期细胞的增殖；中等剂量 HC 的疗效与 ADM 相似，但其作用环节则是阻滞了 G2M 期细胞的增殖。结论 本研究证实了 HC 在体内应用能抑制肝癌细胞的增殖，延缓肝癌的发生发展。【关键
2、词】 肝抑素；大鼠；肝肿瘤；二乙基亚硝胺The effect of rabbit hepatic chalone on rat hepatocellular carcinoma【Abstract】 Objective To study the therapeutic effect and protective effect of experimental hepatocellular carcinoma in rats with rabbit hepatic chalone(HC).Methods Hepatoma rats were induced by diethylnitrosamine
3、(DEN).The changes of hepatoma nodules and ratio of liver/body weight were recorded and the alpha fetoprotein(AFP)，-glutamyl transferase(-GT) and alkaline phosphatase(ALP) and the pathological changes of livers were observed.The cellular dynamic parameters were studied by flow cytometry.Results HC of
4、 high dose group was better than adriamycin(ADM) group，the protective effect might be to postpone advancement of G0-G1 phase cells.HC of appropriate dose group was the same as ADM group，and the protective effect might be to postpone advancement of G2-M phase cells.Conclusion The HC in this study cou
5、ld inhibit the prolifiration of hepatoma cells and delay the forming of hepatoma.【Key words】 hepatic chalone；rat；hepatocellular carcinoma；diethylnitrosamine肝抑素（hepatic chalone，HC）是由生物正常肝细胞通过自分泌和旁分泌作用产生的、能抑制肝细胞增殖的一种分子量为 13500 的多肽蛋白质，它在肝脏的再生调节机制中发挥着重要的作用。有研究1发现 HC 对人肝癌细胞（SMMC-7721 细胞株）在体外的增殖有明显的抑制作用，抑
6、制率为 77.7%，而对人胃癌细胞（BGC-823 细胞株）的增殖则无抑制作用，提示 HC 是抑制肝癌细胞增殖的特异性因子。至于 HC 在体内应用是否可以抑制肝癌细胞的增殖，至今未见有文献报道，因此很有必要对 HC 进行深入的探讨和研究。本研究建立由二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)诱发的大鼠肝癌模型，采用病理学、血清生化指标和细胞动力学的方法，研究 HC 对大鼠体内肝癌的治疗作用和作用环节。1 材料与方法1.1 动物分组 选取健康雄性 SD 大鼠（由广东医学院实验动物中心提供）60 只，体重 100120g，随机分为 6 组(每组 10 只):正常组、模型组、阿霉素
7、（adriamycin，ADM，由浙江海正药业股份有限公司生产）组和 HC（本实验室提纯2）治疗组:A 组，大剂量；B 组，中等剂量；C 组，小剂量。 除正常组外，其余 5 组大鼠在饮水中均加入 0.01%DEN（Sigma 公司产品），喂养 90 天，停止喂养 DEN，然后开始治疗。1.2 治疗方法 正常组和模型组每天 1 次腹腔注射生理盐水 0.5ml/只，而 ADM 组每天 1 次腹腔注射 ADM 3mg/kg，A 组每天 1 次腹腔注射 HC 9mg/kg，B组每天 1 次腹腔注射 HC 3mg/kg，C 组每天 1 次腹腔注射 HC 1mg/kg。给药处理30 天。ADM 剂量的选择
8、以临床化疗剂量 30mg/m2 为依据，按人与大鼠间体表面积折算的等效剂量比值表计算得出。取折算得出的 ADM 剂量为 HC 的中等剂量(3mg/kg)，并由此得出 HC 的大剂量(9mg/kg)和小剂量(1mg/kg)。1.3 常规检查 称体重，解剖大鼠，取出肝脏，称肝重，计算肝重比体重，记录肝表面癌结节数。1.4 生化检测 断头取血，收集血清，用放射免疫测定法检测血清甲胎蛋白（AFP）的分泌量，用 7170A 型自动生化分析仪(由日本岛津公司制造)测 -谷氨酰转肽酶（-GT）、碱性磷酸酶（ALP）的含量。1.5 病理检查 统一取右叶肝组织，福尔马林液固定，石蜡包埋，制备成2厚的切片，HE
9、染色，光镜下观察肝组织的病理变化。1.6 流式细胞仪检测 取 3 块肝组织（每块约为 1g），制备离散肝细胞悬液，以碘化丙啶荧光素染色显示核 DNA，用流式细胞仪（美国 BD 公司产品，FACS Vantage）对样品进行 DNA 含量分析，得出各细胞周期的分布比率。 1.7 统计学方法 各组数据用 xs 表示，组间比较采用 t 检验加方差分析。2 结果2.1 各组大鼠的生存率 实验结束时，各组大鼠的死亡数和生存率见表1。 表 1 大鼠死亡数和生存率模型组 5 只大鼠的死亡原因均为腹腔内出血；ADM 组 3 只大鼠的死亡原因也为腹腔内出血；A 组 2 只大鼠的死亡原因同样为腹腔内出血；B 组
10、1 只大鼠死于恶病质，3 只死于腹腔内出血；C 组 4 只大鼠的死亡原因也是腹腔内出血。2.2 HC 对大鼠肝癌病理改变的影响 尸检发现，正常组肝脏外观正常，无一例出现自发性肝癌，而模型组大鼠的肝脏明显增大，各叶散在大小不等的灰白结节，少数成巨块状。光镜下呈典型的柱状及腺管样癌巢结构，且癌巢周围肝细胞异型性明显，伴癌细胞浸润。ADM 组、A 组、B 组与 C 组大鼠也均有癌结节存在，但肝表面癌结节数明显低于模型组（见表 2），经统计学分析，ADM组、A 组、B 组与模型组的差异有显着性（ P0.05）。而与 ADM 组相比，A、B、C 三组中 A 组的差异有显着性（ P0.05）。在 4 个治
11、疗组的病理切片中，A 组有 5 例优于其余各组，切片显示:细胞排列有序，细胞核大小一致，核浆比例基本正常，病理有丝分裂少见，癌巢周围肝细胞异型性不明显，无癌细胞浸润。B 组与 ADM 组相似，各有 2 例优于模型组，表现为:细胞排列紊乱，胞浆嗜碱性，核分裂相增多，可见多核和巨核细胞，但癌巢数明显少于模型组，且癌巢周围肝细胞异型性不明显，有少量癌细胞浸润。C 组病理切片则与模型组接近。2.3 HC 对大鼠体重、肝重、肝重比体重的影响 与正常组相比，模型组大鼠的体重均明显低于正常组大鼠（ P0.05），肝脏重量和肝重比体重均明显高于正常组（ P0.05）。与模型组相比，ADM 组、A 组、B 组和
12、 C 组大鼠的体重均明显高于模型组（ P0.05），肝脏重量和肝重比体重明显低于模型组（ P0.05）。与 ADM 组相比，A 组和 B 组大鼠的体重高于 ADM 组，肝脏重量和肝重比体重低于 ADM 组，但经统计学分析只有 A 组的差异有显着性（ P0.05）（见表 2）。表 2 ADM 和 HC 对大鼠肝癌结节、体重、肝重、肝/体重比的影响 （xs）注： P0.05，vs 正常组； P0.05，vs 模型组； P0.05，vs ADM 组2.4 HC 对大鼠血清中 AFP、-GT、ALP 的影响 与正常组相比，模型组大鼠的 AFP、-GT、ALP 水平均明显高于正常组（ P0.05）。与模
13、型组比较，ADM 组、A 组和 B 组大鼠的 AFP、-GT、ALP 水平均明显低于 ADM 组（ P0.05）。与 ADM 组相比，A 组大鼠的 AFP、-GT、ALP 水平均明显低于ADM 组（P0.05）（见表 3）。表 3 ADM 和 HC 对大鼠血清中 AFP、-GT、ALP 的影响 （xs）注： P0.05，vs 正常组； P0.05，vs 模型组； P0.05，vs ADM 组2.5 流式细胞仪检测结果 与模型组相比，第 120 天时，A 组 G0-G1 期细胞百分率显着上升（ P0.05）；ADM 组、A 组、B 组和 C 组 S 期细胞百分率显着下降（ P0.05）；B 组和
14、 C 组 G2-M 期细胞百分率显着上升（ P0.05）（见表 4）。表 4 ADM 和 HC 对大鼠不同细胞周期的肝细胞比例的影响 （xs）注： P0.05，vs 模型组3 讨论DEN 为强烈的化学诱癌剂，其所诱发的大鼠肝癌为肝细胞癌，与人肝癌的发生过程相似。本实验采用小剂量长期饮水法3诱发肝癌 70 天，再用ADM 或 HC 腹腔注射，到实验进行到 120 天时，处死大鼠。巨检和组织切片显微观察发现，模型组大鼠肝癌发生率为 100%，证明本次实验中大鼠肝癌模型诱发成功。肝细胞癌变可能是由于在细胞分裂过程中致癌物引起细胞特异基因的改变，如肝细胞特异基因被封闭，以致与之相互联系而又相互阻遏的分
15、裂基因封闭，从而引起增生代谢与特异代谢关键酶活性不可逆的改变，使之失去正常肝细胞增殖与特异功能的平衡，而代之以不受控制的增生，最后形成癌细胞4。而目前肝癌的疗效远不理想的主要因素之一就是能做手术切除的早期肝癌不足1/55。因此，从预防和治疗的角度来看，抑制癌前细胞的增生或促进癌细胞的分化都有重要意义4。AFP 是一种胚胎性蛋白，主要由胚肝产生，在肝癌中分泌量增高，因此，AFP 被认为是诊断肝癌的标志蛋白。-GT 在鼠肝中活性很低，而在诱癌过程中活性逐渐上升，故 -GT 被认为是肝癌变过程中早期癌前病变的生化标志。AFP和 -GT 已被作为维甲酸诱导人肝癌细胞分化的观察指标6。Fanjul 等7
16、研究认为，ALP 可作为肝癌细胞的分化标志。因此，本研究用 AFP、-GT和 ALP 作为观察肝癌细胞恶性表型逆转的指标。结果表明，在诱癌过程中AFP、-GT 和 ALP 有一致性的变化，三者均明显升高，三者联合能更好地观察肝癌细胞的分化。在实验中我们发现，模型组大鼠不仅全部发生肝癌，而且肝重/体重及AFP、-GT、ALP 等指标均明显高于正常组。但是，用不同剂量 HC 腹腔注射后，三种剂量 HC 治疗组大鼠的体重明显高于模型组，肝重/体重明显低于模型组。其中大剂量和中等剂量的 HC 治疗组大鼠的肝表面癌结节数和血清 AFP、-GT、ALP 等指标均明显低于模型组。说明这两种剂量的 HC 不仅能抑制肿瘤细胞的增长，还能促进肿瘤细胞分化。ADM 自世纪 70 年代开始临床应用以来，
