小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建【医学论文】

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1、医学论文-小鼠锌指蛋白基因 Znf230 条件基因打靶载体的构建作者：刘英， 刘运强， 周钦， 陶大昌， 彭艳， 刘合 【关键词】 ,DNA 结合基因蛋白质类；,基因；,聚合酶链反应；,克隆,分子摘要: 目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因 Znf230 条件基因打靶的载体，为产生 Znf230 基因敲除的小鼠模型准备条件。 方法 设计和合成引物，经PCR 从小鼠的基因组中扩增出 5同源臂、3同源臂及锚定序列，长度分别为4，4，1 kb 的片段，反向插入 pBS 载体的 neo 基因的两侧，从而构建小鼠Znf230 条件基因打靶载体 Znf230pBS(5)。 结果 经过限制性内切酶及 DNA 测序

2、鉴定，证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与 Genebank 公布的基因序列一致，表明载体构建成功。 结论 PCR 技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法。运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因 Znf230 的条件基因打靶载体。关键词: DNA 结合基因蛋白质类； 基因； 聚合酶链反应； 克隆，分子已婚育龄夫妇不孕不育症的发病率约 10%15%，其中 50%由男性不育引起。导致男性不育的因素很多,除系统疾病、营养不良、内分泌疾病、精子运送的解剖学上障碍、感染、环境毒物等外，精子发生障碍为一个重要原因,表现为无精子症或少精子症(精子数2106 mL-1)。导致无精症的原因不详，更

3、无有效的治疗方法。为探讨其发病机制，了解疾病的干预因素，必须具有良好的动物模型。基因打靶技术是近年来迅速发展起来的新兴分子生物学技术,对胚胎干细胞(embryonic stem,ES)进行基因打靶是人为特定地修饰和改造细胞染色体遗传性状的有效方法和途径1。Cre/LoxP 系统的引入使从时间和空间控制基因的敲除成为可能，有效的避免了胚胎发育重要基因敲除后胚胎不能存活、从而无法进行后续研究的限制23。条件敲除载体的构建是进行条件基因打靶关键的第一步。一般使用替换型打靶载体,在锚定序列的两侧插入同向的 LoxP 序列和外源性同源序列及正筛选标志基因。正筛选标志基因位于内含子中，可以帮助研究者筛选接

4、受了外源基因的细胞，但不影响细胞和整体的正常功能。笔者尝试运用该法建立 Znf230 基因敲除的小鼠模型，第一步工作就是利用 Cre/LoxP 系统构建条件基因打靶载体。1 材料和方法1.1 材料 限制性内切酶、T4DNA 连接酶购自美国纽英伦公司；高保真Taq 酶(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)和 T 载体(TOPO TA Cloning Kit)购自美国 Invitrogene 公司；pBlueScript 质粒购自美国STRATAGENE 公司。胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自德国QIAGEN

5、 公司。质粒小量抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术公司。所用引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；测序由上海英骏生物技术有限公司完成。1.2 引物设计F1：5CAT ACG CGT GTT TGT TCT CTC TTT CCT TCC3R1：5GCC GCT AGC CCT GTT ACA TAA CCA CAC TAG3用来扩增 5同源臂，并引入酶切位点 Mlu和 Nhe。F2：5CAT GAG CTC CTG AGC TTG GGT CTT CAT TCC3R2：5CTG CAA TTG GTT GAG AAT CCA GAG GGA TGG3用来扩增 3同源臂，并引入酶切位点 Sac和

6、 Mfe。F3: 5CAA GTC GAC GGA CTG TGT GCT TTG GTC AGC3R3: 5CCA TGC TAA GGA CTC AGG AAG GAC ATA AAC3用来扩增锚定序列，并引入酶切位点 Sal和 Bpu10。F4: 5GAT TAC TGG GCC CAT AAC TTC GTA TAG CAT AC3R4:5CGA CCA CTC GAG CAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG3用来扩增带有同向 LoxP 序列的锚定序列，并引入酶切位点 PspOM和Xho。1.3 3同源臂的克隆1.3.1 PCR 扩增 以小鼠基因组为模板，利用引物 F2

7、 和 R2 扩增 3同源臂。反应体系如下：小鼠基因组 DNA 模板 1 L（1 g），10长片段高保真PCR 缓冲液 2.5 L，25 mmol/L MgCl2 2.5 L,20 mmol/L dNTP 8 L,引物F2 和 R2 各 2 L,高保真 Taq 酶 1 L,加水补足体系至 25 L。混匀后置 PCR仪，94 预变性 1 min，然后采用两步法 PCR 按如下程序循环 30 次：94 变性 40 s68 延伸 5 min。最后 72 延伸 10 min。PCR 产物于 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.3.2 连接 T 载体、鉴定及酶切 PCR 产物连入 T 载体，反应体系为 PCR

8、产物 2 L, 反应缓冲液 0.5 L, T 载体 PCR2.1 0.5 L。混匀后室温孵育 5 min，冰浴 2 min，加入感受态大肠杆菌 DH5，混匀后置冰上 30 min，42 热休克 30 s，加入 SOC 培养液 130 L 后于 37 复苏 60 min。取菌液 20 L 涂板，37 培养箱培养过夜，采用蓝白斑及氨苄青霉素筛选。第 2 d 挑选单独的白色菌斑，摇菌并用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，利用内切酶 Sac和 Mfe鉴定，选择有 4 kb 阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化 4 kb 目的条带。1.3.3 连接

9、、转化及鉴定 Sac和 Apo酶切线性化质粒 pBS，取线性化质粒 50 ng 与目的条带按末端浓度比 13 混合，加入 10的 T4DNA 连接酶缓冲液 2 L，T4DNA 连接酶 0.1 L，灭菌去离子水补足体系至 20 L。室温孵育 5 min，冰上放置 2 min，取转化感受态大肠杆菌 10 L，菌液涂布于含有氨苄青霉素的 LB 固定培养板上，37 培养箱培养过夜。第 2 d 挑选单克隆、摇菌并用试剂盒小量抽提质粒，利用内切酶 Nhe鉴定。1.4 5同源臂的克隆1.4.1 以小鼠基因组为模板，利用引物 F1 和 R1 扩增 5同源臂。反应体系如下：小鼠基因组 DNA 模板 0.5 L（

10、0.5 g），10长片段高保真 PCR 缓冲液 2.5 L，50 mmol/L MgCl2 2.5 L,20 mmol/L dNTP 8 L,引物 F1 和R1 各 1.5 L,高保真 Taq 酶 0.5 L,加水补足体系至 25 L。混匀后置 PCR仪，94 预变性 1 min，然后按如下程序循环 30 次：94 变性 40 s58 退火 30 s68 延伸 5 min。最后 72 延伸 10 min。PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.4.2 连接 T 载体、鉴定及酶切 PCR 产物连入 T 载体，反应体系及转化过程同 3同源臂的克隆。利用内切酶 Mlu和 Nhe鉴定，选择有 4

11、kb 阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化 4 kb 目的条带。1.4.3 连接、转化及鉴定 Mlu和 Nhe酶切线性化质粒 hZnf230pBS(3)，取线性化质粒 50 ng，与目的条带按末端浓度比 13 混合，连接反应体系及转化过程同 3同源臂的克隆。第 2 d 挑选单克隆、摇菌并抽提质粒，利用内切酶 Nhe鉴定。1.5 锚定序列克隆1.5.1 PCR 扩增 以小鼠基因组为模板，利用引物 F3 和 R3 扩增锚定序列。反应体系如下：小鼠基因组 DNA 模板 0.5 L（0.5 g），10长片段高保真PCR 缓冲液 2.5 L，

12、25 mmol/L MgCl2 2.5 L,20 mmol/L dNTP 6 L,引物F3 和 R3 各 1.5 L,高保真 Taq 酶 0.5 L,加水补足体系至 25 L。混匀后置PCR 仪，94 预变性 1 min，然后采用两步法 PCR 按如下程序循环 30 次：94 变性 40 s68 延伸 2 min，最后 72 延伸 10 min。PCR 产物于 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5.2 连接 T 载体、鉴定及酶切 PCR 产物连入 T 载体，反应体系及转化过程同 3同源臂的克隆。利用内切酶 Sal和 Bpu10鉴定，选择有 1 kb 阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶

13、切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化 1 kb 目的条带。1.5.3 连接、转化及鉴定 Sal和 Bpu10酶切线性化质粒 pDNR1，取线性化质粒 50 ng，与目的条带按末端浓度比 13 混合，连接反应体系及转化过程同 3同源臂的克隆。第 2 d 挑选单克隆、摇菌并用试剂盒小量抽提质粒，利用内切酶 Bpu10鉴定（酶切产生片段 0.5 kb，1.2 kb 和 3.2 kb）。正确的克隆用引物 F4 和 R4 扩增得到带有同向 LoxP 的锚定序列作为插入片段，PspOM和 Xho酶切 PCR 产物，Sal和 Not酶切线性化质粒 hZnf230pBS(4)，按照前述方法连接

14、、转化、扩增、抽提质粒，利用内切酶 Nhe鉴定。2 结果2.1 PCR 扩增 用特异性引物 F1 和 R1、F2 和 R2、1 和 5:DNA 分子量标记;2:3同源臂;3,4 和 8:阴性对照;6 和 7:5同源臂;9:锚定序列;10:DNA 分子量标记.图 1 同源臂及锚定序列经 PCR 扩增后电泳（略）Fig 1 Electrophoresis of the homologous arms and the targeting sequence amplified by PCR 1,2 和 3:Nhe酶切鉴定 hZnf230pBS(3);4 和 5:DNA 分子量标记;6 和7:Nhe酶切

15、鉴定 hZnf230pBS(5);8:Nhe酶切鉴定 hZnf230pBS(4).图 2 限制性内切酶酶切鉴定小鼠 Znf230 基因打靶载体（略）Fig 2 REase analysis of the mouse Znf230 gene targeting vectorF3 和 R3、F4 和 R4 进行 PCR 扩增，均得到特异性 PCR 产物，所得 PCR 产物分别为 4，4，1，1.1 kb，片段长度和预期一致（图 1）。2.2 3同源臂克隆 采用定向克隆，用 Sac和 Mfe酶切含有插入片段的 T 载体，Sac和 Apo酶切质粒 pBS，连接转化产物采用氨苄青霉素筛选，利用内切酶 Nhe鉴定，正确连接产物酶切产生片段 5.7 kb 和 2.7 kb；若无插入片段者质粒仅被线性化。正确的克隆命名为 hZnf230pBS(3)（图 2）。2.3 5同源臂克隆 采用定向克隆，用 Mlu和 Nhe酶切含有插入片段的 T 载体和质粒 hZnf230pBS(3)，连接转化产物采用氨苄青霉素筛选，利用内切酶 Nhe鉴定，正确连接产物酶切产生片段 5.7 kb 和 6.7 kb；若无插入片段者酶切产生片段为 5.7 kb 和 2.7 kb。正确的克隆命名为 hZnf230pBS(4)（图2）。2.4 锚定序列克隆 用 PspOM和 Xho