《姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究【药学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究【药学论文】（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、药学论文-姜黄素逆转 P 糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究作者：王磊 柯红 王一羽 任东明 【摘要】 目的研究姜黄素对 P 糖蛋白（P-gp）介导的膀胱肿瘤多药耐药的逆转作用。方法采用 MTT 法测定药物的体外杀伤作用，应用流式细胞术测定细胞内罗丹明浓度。结果姜黄素不增加阿霉素对 BIU-87 的细胞毒性作用(P0.05)；而对于 BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P0.05)，逆转指数为4.0。姜黄素明显抑制 P-gp 的药物外排作用可能是关键因素。结论姜黄素通过抑制 P-gp 的药物外排作用有效逆转多药耐药。 【关键词】 姜黄素 P 糖蛋白 阿霉素 多药耐药 逆转化
2、疗是膀胱癌术后治疗的重要方法。膀胱肿瘤具有易复发和产生多药耐药(multidrug resistence,MDR)的生物学特性，加强膀胱癌 MDR 逆转研究具有重要意义。就目前研究而言，MDR 的逆转包括以下策略：使用化疗增敏剂、药物化学修饰、反义技术、载体技术等，对植物药研究较少。本实验拟观察姜黄素能否逆转多药耐受糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的膀胱癌 MDR、逆转效果及其可能机制。1 材料与方法1.1 材料姜黄素（Curcumin,CUR），罗丹明123（Rhodamine-123，R-123）及 MTT 均为 Sigma 公司产品。盐酸阿霉素（Adriamycin，
3、ADR）为深圳万乐药业公司产品。DMEM 培养基为 Gibco 公司产品。膀胱移行细胞癌株 BIU-87，由北京医科大学泌尿外科研究所馈赠；耐药株 BIU-87/ADR 系由本实验室通过采用递增阿霉素剂量的方式诱导建立的呈典型 MDR 表型的耐药细胞亚株。高表达P-gp。细胞在含 0.5 mgL-1 浓度的阿霉素、10%胎牛血清的 DMEM 培养基中以37，5% CO2 条件培养，实验前 2 d 换无药培养基培养。1.2 方法1.2.1 MTT 实验将处于对数生长期的两种细胞分别以 2104/ml 浓度接种于 96 孔培养板，每孔终体积 200 l。上述条件下培养 24 h，小心吸尽每孔培养液
4、。实验组分别加入不同浓度的阿霉素、实验组分别加入不同浓度的阿霉素加姜黄素（以终浓度 0.1%DMSO 助溶）。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5(g/ml)，姜黄素终浓度为 25 molL-1。对照组为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组为不加药物仅加细胞的阴性对照，以上述条件培养 48 h 后，每孔加 MTT(5 mg/ml)液 20 l，37继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加 150 l DMSO，振荡 10 min 使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测 490 nm 处的光吸收值(A)。细胞存活率(IC)= 实验组平均 A 值/阴性对照组平均
5、A 值逆转指数(RI)=IC50(BIU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR)1.2.2 罗丹明外排实验 罗丹明作为 P 糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）的转运底物能较好的代表其转运功能1,2。将处于指数生长期的 BIU-87/ADR 细胞以 2104/ml 接种于 24 孔培养板，每孔终体积 1 ml。上述条件下培养 24 h。小心吸弃培养液，加入罗丹明至终浓度为 5 gml-1，上述条件继续培养 30 min ，吸弃培养液，加入不含罗丹明的培养液。实验组仅含培养液和细胞，实验组在的基础上加入姜黄素至终浓度为 25 moll-1，对照组为
6、含细胞不加药液组。分别于 0，0.5，1.0，2.0 h 收获细胞。细胞收获方法为：吸弃培养液、0.25%胰酶消化、冷 PBS(0)吹洗、离心(800 r/min)3次后，500 l 冷 PBS 吹散细胞，在流式细胞仪上检测(激发波长 480 nm，发射波长 540660 nm)，以荧光强度平均值（Mean）表示细胞内罗丹明浓度。细胞内罗丹明浓度以下式计算：A=实验组平均荧光强度值-对照组平均荧光强度值。1.2.3 统计学处理 实验结果取 3 次实验的均值，标准差均小于 5%，组间显着性差异用 t 检验。2 结果2.1 MTT 试验 预试验以姜黄素最高浓度 25 molL-1 作用两细胞株 4
7、8 h，细胞存活率均在 95%以上，排除了对细胞的毒性作用（见表 1）。结果表明，姜黄素略增加阿霉素对 BIU-87 的细胞毒性作用(P0.05)；而对于 BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P0.05)，逆转指数为 4.0。表 1 细胞毒分析 IC50 （略）*P0.05，*P0.012.2 细胞内罗丹明浓度 图 1 为不同时间段细胞内罗丹明浓度的流式细胞仪检测结果。可以看出，在每一时间点，姜黄素组 R-123 浓度均显着高于无姜黄素组。姜黄素明显抑制了细胞内 R-123 的外排(P0.05)。图 1 R-123 外排实验（略）3 讨论尽管生物技术飞速发展，传统医学在世界的许
8、多地方仍发挥着极其重要的作用。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类色素。姜黄素及其类似物和挥发油是姜黄主要活性成分，具有抗炎、抗菌、保肝、治疗创伤、抗癌、抗病毒等活性。其抗肿瘤作用及机制正受到日益重视。有文献表明，姜黄素对人类恶性肿瘤细胞有诱导分化和增殖抑制作用3，4，近年研究表明，姜黄素可促进肿瘤细胞凋亡5，6，并且与阿霉素、丝裂霉素具有协同作用79；有人认为其具有化疗增敏作用10。本实验结果显示，姜黄素可以有效逆转膀胱肿瘤的 MDR，姜黄素组 BIU-87/ADR对阿霉素的敏感性是无姜黄素组的 4 倍。P-gp 具有 ATP 依赖的生物膜泵功能，能将胞内药物泵至胞外而产生 MD
9、R，R-123 外排实验结果提示，姜黄素直接抑制P-gp 的外泵功能为其机制之一。诸多研究显示，P-gp 既可以单独介导，亦可以参与介导膀胱肿瘤的 MDR，是膀胱癌产生 MDR 的重要机制。由于膀胱癌是人类常见恶性肿瘤之一，具有易复发和产生 MDR 的特性，因此寻找其逆转剂具有重要意义。维拉帕米、环孢素 A 等逆转膀胱肿瘤的 MDR 已有多篇报道11，但未见关于植物药的研究，我们的实验无疑为逆转膀胱癌 MDR 提供了一种新的方法。前述研究表明姜黄素发挥抑瘤效应需要较高浓度，系统用药难以保持持续高浓度，膀胱癌术后，膀胱灌注化疗是重要的治疗手段，由于系局部用药，因而具有较大的可行性。姜黄素能否逆转
10、 MRP 介导的膀胱肿瘤 MDR 及促进膀胱癌细胞凋亡还需进一步研究。【参考文献】1 Chieli E, Santoni-Rugiu E, Cervelli F, et al. Differential modulation of P-glycoprotein expression by dexamethasone and 3-methylcholanthrene in rat hepatocyte primary culturesJ. Carcinogenesis. 1994,15(2) :335.2 张霆均,高翠华,张莉芳. 阿霉素在小鼠体内诱导 S-180 细胞株抗药性的实验研究J. 实
11、用肿瘤杂志,1994,9(2):102.3 孟秀香,宋振岚,贾 莉. 姜黄素对人类红白血病细胞(K562)的抑制及诱导分化作用J. 大连医科大学学报,1999,21(2):98.4 孟秀香,巩 静,孙宏丹,等. 姜黄素在体外对白血病细胞及其时相性影响的观察J. 白血病,2000,9(3):147.5 何 静,陈 燕,吴裕丹,等. 姜黄素对原代急性髓性白血病细胞凋亡及调控蛋白 Mcl-1、Bax、Bak 表达的影响J. 同济医科大学学报,2001,30(4): 327.6 吴裕丹,陈 燕,何 静. 姜黄素在急性髓性白血病 HL-60 细胞中对凋亡调控蛋白 Bax、Bak、Mcl-1 的影响J.
12、同济医科大学学报,2001,30(1):25.7 刘 宝,薛 妍,慕利梅. 姜黄素和阿霉素联合应用对人肝癌细胞SMMC-7721 抑制作用的研究J. 肿瘤研究与临床,2000,12(6):372.8 林 溪,许建华,柯丹如. 姜黄素与阿霉素联合用药的体外抗肿瘤作用J. 中国药理学通报,2000,16(5):522.9 赵 蓉,柯丹如,许建华,等. 姜黄素与 5-氟尿嘧啶对人白血病 K562细胞体外抗癌的协同作用J. 中药药理与临床,1999,15(5):15.10 Iersel ML, Ploemen JP, Struik I, et al. Inhibition of glutathione
13、 S-transferase activity in human melanoma cells by alpha,beta-unsaturated carbonyl derivatives. Effects of acrolein, cinnamaldehyde,citral,crotonaldehyde,curcumin,ethacrynic acid,and trans-2-hexenalJ. Chem Biol Interact 1996,102(2):117.11 郭和清,鲁功成,熊旭林. 环孢素 A 逆转人膀胱癌耐阿霉素细胞亚株BIU-87/ADR 效应的研究J. 同济医科大学学报，2001,30(1):25.
