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1、医学论文-姜黄素诱导人结肠癌细胞株 SW480 凋亡及其bcl2 表达相关性研究【摘要】 探讨姜黄素对人结肠癌细胞株 SW480 诱导凋亡的影响及其作用机制。方法 550姜黄素分别处理 SW480 细胞 648h 后，MTT 法检测细胞的生长活性，流式细胞仪检测细胞周期，TUNEL 法检测细胞凋亡，免疫组化法检测细胞内 bcl2 蛋白表达水平。结果 MTT 显示姜黄素对 SW480 细胞具有细胞毒作用，呈时间 浓度依赖性。FCM 结果显示细胞周期中 G0/G1 期细胞比例增加，S期、G2/M 期比例下降。TUNEL 法显示凋亡细胞数增加，免疫组化结果显示bcl2 基因表达明显减弱。结论 姜黄素
2、能抑制结肠癌 SW480 细胞的增殖并诱导细胞凋亡。其机制可能与干扰细胞周期及下调 bcl2 基因表达有关。 【关键词】 姜黄素 结肠肿瘤 细胞周期 bcl2 基因0 引言姜黄素 (curcumin)是从姜黄中提取的酚性色素，属于天然酚类抗氧化剂，其主要药理作用有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用。研究表明，姜黄素能选择性地抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡1，2，但其中所涉及的机制仍然不十分明确。本研究探讨了姜黄素诱导结肠癌细胞株 SW480 凋亡效应及其对 bcl2 基因表达的影响，现报道如下。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 药物及细胞株 姜黄素为英国 DAH 公司产
3、品。SW480 人结肠癌细胞株由武汉大学典藏中心提供。1.1.2 主要试剂 MTT(噻唑蓝)为美国 Sigma 公司产品。小牛血清、RPMI1640 为美国 GIBCO 公司产品。细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannheim 公司产品。bcl2 免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。1.2 方法1.2.1 细胞培养 SW480 细胞在含 10%小牛血清的 RPMI1640 培养基，37、5%CO2 培养箱中常规传代培养。设对照组和实验组,并根据实验要求加入不同浓度的试剂。1.2.2 噻唑蓝还原法(MTT 法)检测细胞生长抑制率 取对数生长期细胞5104 个/ml，每孔 0.2
4、ml，接种于 96 孔组织培养板中，设 PBS 对照组和不同浓度(550mol/L)的实验组，各设 3 个复孔。置 37、5%CO2 培养箱中培养，分别作用 6h、12h、24h、48h，实验终止前 4h 每孔加 MTT(5mg/ml)工作液20l，上机前除去培养液，每孔加 200l 二甲基亚砜，在酶标仪(570nm 波长)上测量各孔吸光度值(OD 值)，按下列公式计算细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值)100%1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 消化收集各实验组及对照组分别培养24h 的细胞，调整细胞悬液浓度为 1106/ml，上流式细胞仪分析。用
5、multicycle DNA 分析软件进行细胞周期的测定。1.2.4 TUNEL 法检测细胞凋亡 操作步骤按试剂盒说明进行。结果判定：细胞核染为棕黄色的细胞被判定为凋亡细胞。随机选取 5 个高倍视野（400 倍），分别计数凋亡细胞数和细胞总数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。AI=(凋亡细胞数/细胞总数)100%1.2.5 免疫组化法检测 bcl2 的表达 按照 SABC 试剂盒使用说明书操作。显色后用图像分析仪进行图像分析。随机测定 100 个细胞，测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(IOD)，然后求出平均光密度(D)值。1.2.6 统计学分析 实验数据以
6、s 表示，进行方差分析。2 结果2.1 姜黄素对 SW480 细胞的生长抑制 对照组 SW480 细胞体外生长活跃，经 5、10、20、50mol/L 姜黄素处理 648h 后，SW480 细胞生长均不同程度地受到抑制，呈时间 浓度依赖性，见表 1。表 1 姜黄素对 SW480 细胞的生长抑制作用（略）2.2 姜黄素对 SW480 细胞周期的影响 正常状态下，癌细胞大多处于 G1期，S 期次之，G2/M 期最少。对照组 DNA 组方图为典型肿瘤细胞的G0/G1、S、G2/M 峰型。从表 2 可以看出，细胞周期发生明显变化。G0/G1 期比例降低，S 期、G2/M 期比例均增高，呈剂量依赖关系。
7、提示姜黄素可阻断癌细胞从 G0/G1 期到 S 期的发展。2.3 TUNEL 法检测细胞凋亡 结果显示，光镜下阳性细胞及凋亡细胞核染成棕黄色，细胞由梭形变成圆形，细胞皱缩，细胞核固缩，核碎裂等。由表 3可以看出，姜黄素可诱导癌细胞凋亡，且呈剂量依赖关系，且各浓度组间差异具有显着性(P0.05)，见图 1。表 2 姜黄素对 SW480 细胞周期的影响（略）表 3 不同浓度姜黄素处理后细胞凋亡的检测结果（略）a：P0.05，b：P0.01 vs control2.4 bcl2 表达的免疫组化检测结果 bcl2 主要分布在细胞质中,其阳性表现为细胞质呈棕褐色。结果显示经姜黄素处理后 bcl2 表达明
8、显减弱，统计学分析有显着差异（P0.05）。随着姜黄素浓度的增加，bcl2 表达阳性的细胞百分率逐渐降低，具有显着性差异（P0.05），见表 4，图 2。表 4 SW480 细胞 bcl2 表达平均光密度的检查结果（略）a：P0.05，b：P0.01 vs control3 讨论实验研究发现姜黄素可抑制胃癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌的发生24 。本实验通过 MTT 法发现姜黄素对 SW480 细胞生长有明显的浓度依赖性抑制作用。流式细胞仪检测发现经姜黄素处理后 SW480 细胞 G0/G1 期细胞比例明显增多，S 期和 G2/M 期细胞比例明显减少，说明细胞生长被阻滞于 S 期和 G2/M 期，
9、并且此作用同样具有浓度依赖性。ehta 等5报道，以姜黄素处理的数株人乳腺癌细胞均可发生 G2/M 期停滞，但未观察到细胞周期蛋白(cyclin)的明显变化。经姜黄素处理的人结肠癌细胞 HT29 和 HCT15 也同样发生 G2/M 期停滞6。而许建华等7的研究表明姜黄素处理的人肝癌细胞 BEL7402 则发生 S 期停滞。这些结果表明，对于不同组织类型的癌细胞来说，姜黄素对细胞周期的调控可能存在不同的机制。本实验结果表明，姜黄素具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，其干扰细胞周期使阻断于 S 期和 G2/M 期可能是姜黄素抗癌作用的重要机制。肿瘤的发生与细胞凋亡的异常有密切关系，肿瘤细胞凋亡是一个多基
10、因参与调控的复杂过程，凋亡可使肿瘤细胞主动性自杀性死亡。其中 bcl2 家族是其中最重要的基因之一，其编码的蛋白能抑制细胞凋亡。bcl2 通过许多刺激因素如神经营养和增长因子的缺乏、Ca+渗透、热休克、辐射和某些病毒等而阻止细胞死亡，可导致 DNA 受损的细胞持续生存、突变产物聚集，从而促进肿瘤的发生发展。它调节细胞凋亡的作用点可能是影响线粒体释放细胞色素 C8。姜黄素能显着诱导 Hras 转化的人乳腺上皮细胞 MCF10A 细胞凋亡，并在 mRNA和蛋白水平下调 bcl2 基因的表达9。Miyashita 发现 bcl2 蛋白能抑制抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡10。实验结果表明，姜黄素能诱导 S
11、W480 细胞凋亡并降低 bcl2 蛋白表达，提示该基因的表达与姜黄素诱导 SW480 的细胞凋亡有着密切关系。姜黄素诱导 SW480 细胞凋亡，其机制可能是通过下调 bcl2 基因的表达来实现的，但其确切机制尚待进一步研究。（本文图见封 3）（略）【参考文献】1 陈宏，张振书，张亚历，等. 姜黄素对大肠癌细胞周期的影响J. 胃肠病学和肝病学杂志，2000，9（2）:107109.2 闵智慧，李文惠. 姜黄素抑制人胃腺癌细胞增殖及对细胞周期的影响的研究J. 肿瘤防治研究，2004，31（4）：211213.3 Sindhwani P，Hampton JA，Baig MM，et al.Curcu
12、min prevents intravesical tumor implantation of the MBT2 tumor cell line in C3H miceJ.J Urol，2001，166(4): 14981501.4 Holy JM. Curcumin disrupts mitotic spindle structure and induces micronucleation in MCF7 breast cancer cellsJ. Mutat Res，2002，518(1): 7184.5Mehta K，Pantazis P，McQueen T，et al. Antipro
13、liferative effect of curcumin (diferul oylmethane) against human breast tumor cell linesJ.Anticancer Drugs，1997，8(5): 470481.6 Chen H, Zhang ZS, Zhang YL, et al. Curcumin inhibits cell proliferation by interfering with the cell cycle and inducing apoptosis in colon carcinoma cellsJ.Anticancer Res，19
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