《酶分子修饰压缩》ppt课件

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1、第六章 酶分子修饰,教案,什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。,酶分子修饰的意义,稳定酶的天然构象 保护活性部位 维持酶功能结构的完整性 降低酶的抗原性 改变酶学性质,回本章目录,第一节 酶的化学修饰,化学修饰：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 即利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。,一、化学修饰分类,（一）酶分子主链修饰 （二）酶分子侧链基团修饰

2、（三）大分子结合修饰 （四）氨基酸置换修饰 （五）金属离子置换修饰 （六）亲和修饰,（一）酶分子主链修饰,利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 主链切断修饰 主链连接修饰,1、主链切断修饰,主链切断的三种情况： 活性中心破坏失活 活性中心完整保持活性，改变抗原性 有利于活性中心的形成显示活性或活力提高,胃蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原的激活,胰凝乳蛋白酶原的激活,2、主链连接修饰,将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或多种催化活性。,（二）酶分子侧链基团修饰,酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨基酸残基上的功

3、能团。 包括：氨基（-NH2）、羧基（-COOH）、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。,氨基修饰,使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂 修饰剂:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。 含有氨基的氨基酸：赖氨酸等,常见基团的化学修饰反应：氨基,教案,羧基修饰剂,可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。 修饰剂:碳化二亚胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL 含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等,常见基团的化学修饰反应：羧基,教案,巯基修饰剂,两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯基具有很强的亲核性，巯基一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 修饰剂：二

4、硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等,常见基团的化学修饰反应：巯基,教案,胍基修饰剂,精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下与精氨酸反应，目前关于精氨酸的修饰的研究主要集中在二羰基化合物上。,常见基团的化学修饰反应：胍基,教案,酚基修饰剂,蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。 修饰方法：碘化法、硝化法等 修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。,常见基团的化学修饰反应：酚基,教案,咪唑基修饰,组氨酸含有咪唑基，咪唑基多为酶活性中心的必须基团 修饰剂： 碘乙酸、焦炭酸二乙酯,常见基团的化学修饰反应：咪唑基,教案,吲哚基,色氨酸含有吲哚基，色氨酸残基疏水性强，

5、通常位于分子内部，难于修饰 修饰剂： N溴代琥珀酰亚胺 2羟基5硝基苄溴 4硝基苯硫氯,常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基,教案,分子内交联修饰,含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺 、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法,（三） 酶的大分子修饰,采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团(共价)结合使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法,非共价修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 如多元

6、醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白质。,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,共价修饰,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，

7、以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,应用最广的修饰剂,聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、无抗原性，分子末端有可活化的羟基，活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。 可用多种不同试剂活化，修饰不同基团 聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺 聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺,将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法称为氨基酸置换修饰,(四)

8、氨基酸置换修饰,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法 例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,1.化学修饰方法氨基酸置换,2.定点突变法氨基酸置换,现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的

9、操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。,定点突变过程,1、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问题） 2、突变基因序列的确定（考虑物种差异） 3、突变基因的获得（DNA合成仪PCR） 4、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）,（五）金属离子置换修饰,1、概念 2、作用范围 3、常用金属离子 4、方法步骤,1、概念,通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。,2、作用范围,含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分

10、，对酶的活性起重要作用。 （ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。 （ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。,3、常用金属离子,（往往是二价离子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2+，Co 2+，Cu 2+，Fe 2+等。,4、金属离子置换修饰的过程,a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA

11、-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。 c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,（六）亲和修饰,亲和标记是一种特殊的化学修饰方法，它利用酶与底物的亲和能力，使用与底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性中心上的氨基酸残基进行共价修饰修饰。,二、酶修饰后的性质变化,热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的

12、抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。,回本章目录,侧链基团修饰的主要作用,1.研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。 2.测定某一种基团在酶分子中的数

13、量 3.提高酶活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性、引起酶的催化特性和催化功能的改变 4.获得自然界原来不存在的新酶种 5.用于酶蛋白分子的固定化,大分子结合修饰的效果,提高酶活力结合后酶空间构象的改变使活性中心更有利于和底物结合，形成催化部位 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍,增强酶的稳定性空间结构更为稳定，活性中心得到保护,降低或消除酶的抗原性分子结构的改变使抗体不能识别 提高抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效

14、。,三、化学修饰方法的几个问题,决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中： 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等； 选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）； 选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。 参考：酶工程 P.86,(一)、试剂的选择要根据修饰目的选择,例如对氨基修饰可有

15、几种情况 修饰所有氨基而不修饰其它基团； 仅修饰-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基； 修饰具有催化活性的氨基；,用于修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应具备：,选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性条件下进行； 修饰反应的程度能简单测定；,(二)、反应条件的选择,不造成蛋白质的不可逆变性（通过对照实验）； 有利于专一性修饰（小心控制条件，尽可能在酶蛋白特定构象不变或少变的情况下进行）； 温度、pH、反应介质和缓冲液；,在所有影响化学修饰的反应条件中,pH值是最重要的一个条件,因为它决定了具有潜在反应能力的功能基团所处的可反应和不可反应的解离状态。 一般情况下,增加pH可以提高反应速率

16、,降低pH可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂可以在生理pH下与蛋白质耦合;而反应活性较低的修饰剂通常需要较高的pH。修饰反应的专一性则对应有一个优化pH值。,(三)、反应的专一性,除考虑修饰试剂专一性、控制反应条件外，还可利用其它途径来实现修饰专一性： 亲和标记试剂（如甲基苯磺酰氟作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上） 差示标记（在底物或抑制剂存在下进行化学修饰 利用蛋白质状态的差异（如在结晶状态下反应）,四、酶化学修饰的应用,在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长 它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性 和抗原性。 在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱 和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学 性质。 在酶结构功能研究中： 1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究； 2.确定氨基酸残基的功能； 3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。,五、酶蛋白化学修饰的局限性,1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。 2.化学修饰后酶