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1、药学论文-夏枯草高效液相色谱指纹图谱的研究作者：杨辉 李军 郭伟英 赵咏 【摘要】 目的： 建立夏枯草的指纹图谱分析方法，并对不同产地的夏枯草进行指纹图谱的比较研究。方法：以齐墩果酸为参照，采用高效液相色谱法，色谱柱为 Hypersil C18，流动相为甲醇：水：醋酸（86：14：0.1），检测波长为 208nm，流速为 1ml/min。结果： 标出 10 个主要共有峰，方法学考察表明，本研究建立的分析方法有较好的重现性，比较了不同产地夏枯草药材与标准药材指纹图谱的相似性。结论： 方法稳定、可靠、简便，为提高夏枯草药材质量控制提供依据。 【关键词】 夏枯草； 高效液相色谱； 指纹图谱夏枯草为唇
2、形科植物夏枯草 Prunella vulgaris L.的干燥果穗，我国各地均产，主产于江苏、浙江、安徽、河南等地1。夏枯草临床应用广泛，药典中载有“清火、明目、散结、消肿”2之功效，现代研究表明夏枯草还具有降血脂，降血糖，免疫抑制以及抗肿瘤等作用3。目前，市场上夏枯草产地多，质量不一，缺乏统一质量检测标准，通常采用测定其中一、两种化合物含量的方法来进行质量评价，不足以全面反映药材的整体质量。本研究利用高效液相色谱法对夏枯草进行了指纹图谱的研究，结果表明，本方法稳定、可靠、重现性好，可为夏枯草药材质量控制提供有效的参考依据。1 仪器与试药日立高效液相色谱仪，DAD 检测器，EZChrom El
3、ite 色谱工作站；KQ100A型超声波清洗器；电子天平。夏枯草对照药材及齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。夏枯草药材分别购自各地药材市场和药店，经鉴定为夏枯草药材的干燥果穗。甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Hypersil C18，4.6*250mm，10m；流动相：甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）；检测波长为 208nm；流速为 1ml/min。2.2 供试品溶液的制备将夏枯草药材择去杂质，60恒温干燥，粉碎机粉碎，粉末过 40 目筛，反复进行，直至药材粉碎全部过筛为止。精密称定夏枯草药材粉末约 1g，加入 90%甲醇 20ml，超声 3
4、0min，过滤，洗涤，合并滤液和洗液，挥干溶剂，残渣加流动相溶解定容至 10.00ml，溶液用微孔滤膜过滤，得夏枯草液，10l 进样。2.3 流动相的选择试验过程中，系统比较了不同配比的甲醇 水（80：20；84：16；86：14；88：12）和乙腈 水（80：20；85：15；90：10）及添加剂的用量。结果表明，以甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）为流动相系统效果较佳。2.4 检测波长的选择试验采用 DAD 检测器，在波长 190400nm 范围内进行夏枯草样品的吸收情况考察。通过比较各不同保留时间的峰的紫外吸收光谱，得知多数峰的最大吸收在 203210nm 范围，少数在 230nm 附
5、近，综合比较各波长处的色谱图，最终确定 208nm 作为检测波长。2.5 参比峰的选择为消除测定结果的系统误差，选取与其它组份分离较好、峰形对称、保留时间 24.617min 的色谱峰作为参比峰（经与标准品色谱图谱及紫外吸收图谱对照，得知此组份为齐墩果酸），以便计算夏枯草药材共同特征组份的相对保留时间和相对含量4。夏枯草标准药材的色谱图及齐墩果酸标准品色谱图见图 1 和图 2。2.6 方法学验证2.6.1 精密度试验 同一夏枯草样品液，在相同条件下，重复进样 5 次，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的 RSD%。结果见表 1。2.6.2 重现性试验 同一夏枯草样品在相同条件下平行提取 5 份，
6、分别进样，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的 RSD%。结果见表 2。2.6.3 稳定性试验 同一夏枯草样品液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h 进样，计算所得色谱图中各相对应的保留时间和峰面积的 RSD%。结果见表 3。图 1 夏枯草标准药材色谱图（略） 图 2 齐墩果酸标准品色谱图（略）表 1 精密度试验（略）表 2 重现性试验（略）表 3 稳定性试验（略）2.7 夏枯草 HPLC 指纹图谱的建立按供试品的制备和检测方法，对 31 份夏枯草药材分别测定色谱图。比较各夏枯草药材的色谱图，结合各组份峰的紫外吸收特征，确定相同组份峰，计算各组份相对保留时间及相对峰面积。i
7、=ti / ts ， 为相对保留时间，ts 为内参峰保留时间，ti 为其它组分保留时间。Ar=Ai100/A ，Ar 为相对面积值，Ai 为各组分面积值，A 为总峰面积。选取 10 个主要共有峰为特征峰，其面积和占到总面积的 99%以上，建立夏枯草样品药材的 HPLC 相对保留值指纹图谱。结果见表 4，其中 i 为 31 种样品谱图中相同组份的相对保留时间值的平均值。2.8 夏枯草 HPLC 指纹图谱相似度的计算以 10 批夏枯草对照药材的 HPLC 图谱为标准，用计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件计算 31 个夏枯草样品药材的 HPLC 图谱与对照药材的相似度。结果见表 5。表 4 夏枯草
8、样品药材的 HPLC 相对保留值指纹图谱（略）表 5 样品相似度计算结果（略）3 讨论对夏枯草的高效液相色谱条件进行了考察，包括流动相的组成、配比等，并依据不同保留时间峰的紫外吸收特征确定检测波长。确定色谱条件为：流动相为甲醇 水 醋酸（86：14：0.1）；流速为 1ml/min；进样量为 10l；检测波长为 208nm。在此色谱条件下，基线稳定，各峰得到了较好的分离，峰形、保留时间等也较好。对中药夏枯草的 HPLC 指纹图谱进行了系统的研究，建立了 31 种夏枯草样品药材的 HPLC 相对保留值指纹图谱，并进行了夏枯草样品药材与标准药材相似度的研究。为夏枯草药材的质量控制提供了依据，为建立规范化的夏枯草种植基地提供了有效的质量控制手段。【参考文献】1 郑汉臣，蔡少青药用植物学与生药学.北京：人民卫生出版社，2004，3892 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2005，1971983 孙维广，廖慧丽，叶志明，等夏枯草化学及药理研究概况.中国中医药信息杂志，2003，10（8）：86884 邹纯才，方洪壮，刘娟，等数字化色谱指纹谱及其在中药研究中的应用.黑龙江医药科学，2005，28（5）：5456
