《固相合成法制备环肽Hymenistatin1及其含statine的类似物【药学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固相合成法制备环肽Hymenistatin1及其含statine的类似物【药学论文】（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、药学论文-固相合成法制备环肽 Hymenistatin1 及其含statine 的类似物【摘要】 目的 研究固相合成法制备 Hymenistatin1 HS1 ，序列为cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle) 及其 statine 类似物的工艺步骤和影响因素。方法 采用 Fmoc 或 Boc 保护 氨基，以 HBTU/NMM为缩合剂进行直链肽接肽反应、以 BOP/HOBt/DIEA 为缩合剂进行环化固相合成HS1 及其类似物。用色谱仪和质谱仪对合成的环肽及其杂聚肽类似物进行纯化鉴定。结果 多肽合成收率可达 65%，经反相高效液相色谱(RPHPLC) 柱对合成的多肽进行纯化
2、后纯度均达到 90%以上，通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDIMS) 检测所合成的环肽及环肽类似物的分子质量与理论分子质量相符。结论 成功合成出了较高纯度的目标多肽化合物。 【关键词】 固相多肽合成； HS1 ； Statine 类似物； 纯化ABSTRACT Objective Preparation of Hymenistatin1 HS1, cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle) and its four statineanalogues by solidphase peptide synthesis method, and the synthesis
3、 process and influencing factors were investigated. Methods Using the Fmoc or Boc protected amino acids, HBTU/NMM as coupling reagent (linear peptide synthesis) and BOP/HOBt/DIEA as cyclizing reagent, the cyclooctapeptide HS1 and its analogues were synthesized. The target peptides were purified by R
4、PHPLC and identified by MALDIMS. Results The purity of the five peptides exceeded 90% and the yields up to 65%. The molecular weights of the synthesized peptides were identified by mass spectrogram. Conclusion The target peptide compounds with higher purity were synthesized.KEY WORDS Solidphase Pept
5、ide Synthesis; HS1; Statineanalogues; PurificationHymenistatin1(HS1) 是由 Pettit 等1从太平洋 Hymeniacidon 海绵中分离得到的一种环八肽。肽链序列为：cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle) 。有报道称 HS1 在小鼠成淋巴细胞白血病 P388 的研究中具有抑制细胞生长的作用，但结果并没有在后续的研究中得到充分证实2。Cebrat 等3揭示了 H1 具有抑制体液和细胞免疫反应的免疫抑制作用。Poojary 等4合成的 HS1 显示出对细菌生长的抑制作用，但对真菌的抑制作用不强；HS1
6、的驱虫作用不大，但表现出一定的抗炎症作用。Zubrzak 等5用 1，5 二取代四唑环修饰 HS1 之后，修饰物的免疫抑制活性变化不大。Statine 是羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGCoA ，胆固醇合成限速酶)的竞争性抑制剂，具有多种免疫调节作用和细胞效应，且不依赖于血液胆固醇的降低。 有研究表明， statine 不但可以抑制 IFN 刺激诱导的人巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的 MHCII 抗原的表达6，还可以选择性阻断整合素2、白细胞功能抗原1(LFA1 ，即 CD11a/CD18)的表达7。这些功能与statine 对 HMGCoA 的抑制作用无关，提示 statine 也是一
7、种潜在的免疫抑制剂。天然 HS1 的生物学活性较弱，不能作为免疫抑制剂应用。本文研究拟采用 statine 对 HS1 进行修饰，以期能够有效提高 HS1 的免疫抑制活性。天然 HS1 结构中的氨基酸残基都是疏水性氨基酸，并且是环状结构，致使化学合成极其困难。为此，本文还希望通过修饰降低 HS1 的疏水性，提高HS1 在水溶液中的溶解性。下面报道 HS1 及 4 个新化合物的设计、固相合成与分离纯化方法。1 实验部分1.1 仪器与试剂多肽合成仪(CS536，美国 CSBio 公司)，半制备型高效液相色谱仪(Waters Delta Prep4000，美国 Waters 公司)，分析型高效液相色
8、谱仪(Agilent 1100，美国 Agilent 公司)，冷冻干燥机(Christ Alpha，德国 Christ 公司)，激光解吸电离飞行时间质谱仪(LCQ Deca，美国 ThermoFinnigan 公司)，紫外分光光度计(Beckman DU7400，美国 Beckman 公司)，C18 反相分析柱(Sepax GPC18 ，5m，120 ，4.6mm150mm)。实验所用 FmocProMerrifield Resin(取代值 0.291mmol/g，交联度1%，100200 目)、BocValWang Resin(取代值 0.523mmol/g，交联度1%，100200 目)、
9、FmocProCTC Resin(取代值 0.42mmol/g，交联度1%，100200 目)、BocTyr(tBu)OH 、BocProOH 、BocIleOH 、BocLeuOH 、FmocTyr(tBu)OH 、FmocProOH 、FmocIleOH 、FmocLeuOH 、Bocstatine(3s ，4s)OH 、HATUO(7 偶氮苯并三氮唑1 氧)N ，N，N，N 四甲基脲六氟磷酸酯、HBTU(苯并三唑1 四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N 羟基苯并三唑)、BOP(邻苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N 二异丙基乙胺;二异丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DM
10、SO(二甲亚砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC1 乙基3(3 二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐、NMM(N甲基吗啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶经重蒸后使用，水为二次去离子水。1.2 HS1 及其类似物的化学合成本文所合成的 5 种环肽序列分别为：HS1 ：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7Leu8) ；A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6Pro7Leu8) ；A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6Pro7Leu8) ；A3HS1：cyclo(Ile1
11、Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6statine7Leu8) ；A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5Val6Pro7Leu8) 。 虽然这 5 种环肽或环肽类似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照顺序给每个氨基酸残基做了编号，但考虑到每个化合物的疏水性和空间位阻可能并不完全相同，加之合成的线性肽链终究要环化成环肽，因此，为了方便、有效地合成目的产物，我们选择接肽反应的第一个氨基酸也不尽相同。(1)HS1 的合成路线与纯化树脂溶胀 调用自编程序 Method1，树脂溶胀的具体方法是将FmocProCTC Resin 4.76g(合成规模为 2
12、.0mmol)用 200ml DMF 浸泡 30min，使之充分溶胀，然后抽干。脱除氨基保护基 调用自编程序 Method2，具体方法为加入含 20%哌啶的DMF 溶液 20ml，搅拌反应 30min，再抽干。然后用 DMF 洗涤 5 次，以除去残留的脱保护试剂。手工取样，茚三酮检测，若树脂呈深蓝色，则表明 Fmoc 保护基已经脱除。接肽反应 调用自编程序 Method3，具体方法是在反应器中加入溶解有3.33g FmocValOH 的 200ml DMF 溶液，机械搅拌 2min，然后加入 HBTU 3.57g，最后加入 NMM 2.02gAAHBTUNMM(mol/mol)=32.856，
13、反应30min。抽干，用 DMF 洗涤 3 次，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工进行茚三酮检测，检测结果若树脂呈现无色，则说明反应比较完全。依次调用程序 Method2 和 Method3，按肽链的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH 、FmocProOH 、FmocProOH 等重复以上接肽反应，直至最终合成出所需肽链。合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu。各氨基酸的投料比、接肽反应时间和脱保护基时间如表 1 所示。后续类似物的合成中，表 1 所列参数基本不变。BocstatineOH 的投料比为 2，接肽反应时间为 40
14、min，脱保护基时间为 30min。肽链的切割 将合成肽链用切割液TFATIS(triisopropylsilane)H2O=95.02.52.5在低于 20的条件下切割，反应时间为 2.5h，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000 表 1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反应时间 r/min 离心 3min，真空干燥 12h，得线性肽链的粗品约 1.5g。 肽链的环化 将线性多肽粗品 1.4g 用 200ml DMF 溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和 DIEA(5eq，1.1g)，过夜环化。加入
15、 EDC 可以加速缩合反应。蒸干 DMF，得环肽粗品 1.35g，粗品用MALDITOF 质谱仪进行分析鉴定。环肽粗品的纯化 将上述环化粗品肽溶于适量 DMSO 中(由于此肽的水溶性不好，上样浓度要严格控制在小于 1mg/ml)，上样样品用 5m 的滤纸过滤。制备色谱柱为 Waters XBridge C18、5m 反相柱；洗脱液：A 液为 0.1% TFA的水溶液，B 液为含 0.1% TFA 的乙腈水溶液；检测波长 220nm。采用 60min 内B 液由 30%65%的线性梯度洗脱方式，流速为 38ml/min。收集纯度高于 95%的馏分。最后冷冻干燥，得 100mg 纯度大于 90%的最终产品。分析型 HPLC 检测纯度 色谱柱为 SepaxGPC18 反相柱(4.6mm150mm，5m，120) ；洗脱液：A 液为 0.1% TFA 的水溶液，B 液为含0.1% TFA 的乙腈水溶液；检测波长 220nm。采用 20min 内 B 液由 60%80%的线性梯度洗脱方式，流速为 1.0ml/min。MS 鉴定 激光解吸电离飞行时间质谱仪检测目标产物
