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1、临床医学论文-土槿甲酸对接种于小鼠腋下的肉瘤 180 细胞的抑制作用作者：王冶 邵丽珠 赵维诚 车光升 张晖【摘要】 目的 探讨土槿甲酸（PAA）对接种于小鼠腋部皮下的肉瘤180（S180）细胞的抑制作用。方法 在小鼠腋部皮下接种 S180 细胞，随后用不同浓度的 PAA 给各组小鼠作腹腔注射 7 d。继续饲养 5 d 后处死小鼠，称瘤重，在光、电镜下观察瘤组织发育状况。结果 不同浓度的 PAA 抑瘤效果亦不同。浓度稍大者抑瘤效果较好。PAA 对瘤块生长、瘤细胞体积和瘤细胞分裂等均有抑制作用，并能促进瘤细胞凋亡。结论 PAA 能够抑制接种于小鼠体内的 S180 细胞的分裂与增殖，促进瘤细胞凋亡
2、，并因此而延长了实验组小鼠的寿命。 【关键词】 土槿甲酸； 肉瘤 180 细胞； 瘤细胞凋亡【Abstract】 Objective To investigate the inhibitive effect of pseudolaric acid A (PAA) on sarcoma 180(S180) cells inoculated into the hypoderm of mouse armpit. Method S180 cells were inoculated into the hypoderm of mouse armpit. Different concentration of
3、 PAA was then given to these mice for seven days by way of peritoneal cavity injection. Five days later，the mice were killed. The tumors were cut off and weighed，and made into sections for light microscope and electron microscope observation. Result The inhibitive effects of PAA on S180 cells were d
4、ifferent due to different concentration of PAA given to the mice. The greater the concentration of PAA，the more obvious the inhibitive effect of it. Both mitosis and growth of the tumor cells were inhibited by PAA. Obvious apoptosis of tumor was seen under microscope. Conclusion PAA is able to inhib
5、it growth and proliferation of S180 cells and accelerate the apoptosis of S180 cells. 【Key word】 Peudolaric acid A(PAA); S180 cells;Apoptosis of tumor cells.土槿皮是松科植物金钱松的树皮。据文献报道，中国民间曾有人用土槿皮浸剂治疗肝病1。近年来有人将土槿皮提取成分用于抑制体外培养的肿瘤细胞的生长，取得了较好的抑瘤效果2，3。国内用土槿皮提取成分抑制动物体内肿瘤生长的报导尚不多见。本研究用土槿皮的提取物土槿甲酸（pseudolaric aci
6、d A，PAA，MW406）治疗腋下接种肉瘤 180（S180）细胞的小鼠，取得了较为显着的抑瘤效果。1 材料与方法11 材料 PAA 及胎牛血清由中国医科大学生物化学研究所提供。S180细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供。BALB/C 昆明种小白鼠由中国医科大学实验动物中心提供。DMEM 培养基为 Sigma 公司产品。12 动物分组 将 60 只小白鼠（雌性，体重 1822 g）随机分成 3 组，即空白对照组（10 只），实验对照组（10 只）和给药组（40 只）。13 方法131 肿瘤细胞接种于小鼠 将 S180 细胞株培养于含有 10 %胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U
7、/mL 青霉素及 100 g/mL 链霉素的 DMEM 培养液中（37 孵育箱，含 5 % CO2）。于对数生长期将 S180 细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为 2106 个/mL。各组小鼠均于右侧腋窝皮下注射 S180 细胞悬液，每只鼠 0.2 mL。132 给药并观察抑瘤效果 用生理盐水将 PAA 稀释成 1 %、2 %、4 %、8 %等 4 种不同浓度的溶液。将接种了 S180 细胞的给药组 40 只小鼠随机分为 TA、TB、TC、TD 4 组，每组 10 只。接种 S180 细胞 24 h 后开始给每只小鼠腹腔注射 PAA 药液，0.3 mL/d，共给药 7 d（TA、TB、TC、TD
8、 组小鼠分别接受1 %、2 %、4 %、8 %的 PAA 药液注射）。空白对照组小鼠只接种瘤细胞而不作任何腹腔注射。实验对照组则在接种瘤细胞后每日接受 0.3 mL 生理盐水注射。停止给药后继续饲养 5 d。随后称量各组小鼠体重并处死，剪开腋下皮肤，小心暴露瘤组织，取下瘤块，清除周围组织，称重，计算给药组（TA、TB、TC、TD）与各对照组的瘤块重量比，验证不同浓度药物的疗效。继而取各组瘤组织按常规方法制作电镜标本，置 H600 透射电镜下观察。将其余瘤组织制成光镜切片标本（石蜡切片，HE 染色），置普通光学显微镜下观察。2 结果21 大体观察及称量结果 空白对照组与实验对照组小鼠至实验第 1
9、3 d取材时死亡率分别为 40 %（4 只）和 30 %（3 只），而各给药组小鼠则无一死亡。空白对照组与实验对照组小鼠右侧腋窝部隆起，可触及半球形或长椭圆形瘤样赘生物。较大的赘生物长 12 mm，较小者长 67 mm。右前肢活动受限。实验治疗组的 TA、TB 2 组小鼠腋下的赘生物体积小，较难触及。TC、TD 组小鼠腋下未触及肿块，右前肢活动自如。各组小鼠体重及赘生物称量结果见表 1。表 1 对照组及给药组小鼠体重及赘生物称量结果（略）注：空白对照组与 TA: P0.05;空白对照组与 TB、TC、TD：P0.0122 光镜观察结果 光镜下，空白对照组和实验对照组瘤组织有下述特点：瘤细胞密集
10、生长。瘤细胞异型性较明显，即细胞大小不等，胞质嗜碱性较强，常见核分裂相，核质比较大。瘤细胞凋亡现象不多见。瘤组织内小血管较丰富。瘤组织周围结缔组织被膜较薄。给药组动物的瘤组织则随药物浓度增大而具有以下特点：瘤细胞密度变小，异型性降低。瘤细胞随着药物浓度加大而逐渐出现明显的凋亡现象，即瘤细胞出现典型的核固缩和核碎裂，胞质变性，胞体破裂。在放大 400 倍的镜下，观察每个药物浓度组 50 个视野的瘤细胞，统计瘤细胞凋亡数，换算成百分率。见表 2 。大片瘤细胞死亡后，形成破碎而无结构的嗜酸性组织。瘤细胞之间疏松结缔组织稍增多，小血管不发达，并出现典型的脂肪细胞。给药组动物与对照组动物瘤细胞光镜测算结
11、果见表 2。表 2 给药组与对照组动物瘤细胞光镜测量结果（略）23 电镜观察结果 空白对照组和实验对照组瘤细胞有如下特点：细胞核体积较大，染色质粗大呈大小不等的块状。核仁清晰。可见核分裂相。细胞质的游离核糖体、粗面内质网和高尔基复合体发达。给药组动物的瘤细胞则随药物浓度增大而具有以下特点：细胞核体积小于对照组细胞，染色质密度降低，呈较小的块状或棉絮状。核仁数少于对照组细胞。核分裂相少见或完全消失。细胞质的游离核糖体、粗面内质网和高尔基复合体不如对照组发达。TC 和 TD 等较高浓度药物组的瘤细胞出现典型的细胞凋亡现象，即核固缩成密度高、染色深、无结构和圆形、椭圆形小体，或核碎裂成多个无结构、着
12、色深的不规则小块。细胞器数量明显减少甚至消失，结构模糊不清。TC 和 TD组的许多瘤细胞在完全凋亡后形成了无结构的细胞残余体。3 讨论S180 肉瘤细胞是以小鼠为宿主的恶性肿瘤细胞。它具有生长快、恶性度高、局部浸润性生长的特点。接种该瘤细胞而不加治疗的小鼠 30 d 死亡率为 95 %2。本实验利用生理盐水和中药土槿皮的精提取物 土槿甲酸配制成不同浓度的药液，以腹腔注射的方式控制小鼠体内的 S180 肉瘤细胞的增殖，收到了良好的效果。瘤细胞凋亡率随药液浓度的增大而逐渐升高。光、电镜的观察结果完全证实了药物的抑瘤作用。近年来，有人3，4，5利用土槿皮的提取成分（土槿甲酸和土槿乙酸等）处理培养中的
13、数种肿瘤细胞，发现受试的肿瘤细胞均出现生长抑制和细胞凋亡现象。这表明土槿皮提取物的单一有机成分可以用来抑瘤抗瘤。肿瘤细胞凋亡是十分复杂的程序性死亡过程，主要涉及到促进凋亡基因的表达和抑制凋亡基因的表达及相互消长6。中药抗肿瘤的机制除了细胞毒作用外，对上述两大类基因的调控是较为重要的方面。本研究通过实验动物的在体实验对 PAA 的抑肿瘤效应做了评价。该实验结果为抗肿瘤新药土槿皮的进一步开发提供了组织病理学依据，还为肿瘤细胞凋亡的细胞生物学检测提供了参考数据。【参考文献】1 竺叶青，马瑾瑜，陈明华，等. 八种生药体外抗肝癌作用的实验研究J. 上海医科大学学报，1989，16（3）：240.2 买霞，陈莉，陈小义，等. 土槿甲酸对 MGC83 细胞抗肿瘤活性的研究J. 实用肿瘤学杂志，2002，16（1）：12. 3 姜孟臣，陈虹，张敏，等. 土槿乙酸对人黑素瘤细胞增殖抑制作用研究J. 中草药，2003，34（6）：532534.4 张敏，买霞，陈小义，等. 土槿乙酸体外诱导 K562 细胞凋亡的研究J. 中草药，2002，33（6）：533535.5 李晓丹. 细胞凋亡，国外医学：生理、病理学与临床分册J，1997，17（6）：231.6 徐淑云，卞如濂，陈修. 药理实验学方法M. 3 版，人民卫生出版社，2002，17661767.
