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1、医学论文-口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性作者：张素欣，王士杰，单保恩，段玉芹，许艳枝 【关键词】 口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖Biological characteristics of monocytederived dendritic cells from peripheral blood of patients with oral carcinoma【Abstract】 AIM: To investigate the morphology, phenotype and functions of dendritic cell (DC) from peripheral blood
2、of the healthy individuals and the patients with oral carcinoma. METHODS: Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or above were assigned to study group and 15 healthy volunteers to control group. Monocytes were isolated by density centrifugation, and cultured in the presence of GMCSF, I
3、L4 and TNF for 7 d in vitro. The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron microscopy. The expressions of CD83, CD1a, CD86, CD80, HLADR were analyzed by flow cytometry. The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte r
4、eactions (MLR) was determined with the method of MTT. RESULTS: Morphologically and phenotypically typical DC was obtained in the 2 groups after culture for 7 d. The expression rates of CD83, CD1a on DC from the patients were 49.39.5 and 48.17.3 respectively，significantly lower than those from health
5、y volunteers (P0.05). Moreover, the mean fluorescence intensity of CD83, CD1a, CD80, CD86 and HLADR expressed in study group were 4.802.13, 3.961.15, 19.638.12, 12.336.75 and 39.447.9, respectively, which were lower but not statistically different from the control group (P0.05). In addition, DC from
6、 the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro. CONCLUSION: Monocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocyt
7、es, and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma.【Keywords】 mouth neoplasms; dendritic cell; phenotyping; proliferation【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法： 口腔癌患者（实验组）及正常人（对照组）15例外周血单个核细胞经 GMCSF,IL4 及 TNF 诱导培养, 获取成熟 DC, 光镜和电镜观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞表型如 CD1a,CD83,CD80,CD86
8、 和HLADR 等分子的表达变化，用噻唑蓝（MTT）法检测 DC 与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应（MLR）中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果： 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外 7 d 诱导培养，均诱导出具有典型形态和表型的 DC,其中实验组细胞的 CD83，CD1a 表达率分别为 49.39.5 和48.17.3，与对照组两者表达率 62.17.9 和 60.26.8 相比,差异有统计学意义(P0.05);实验组 DC 细胞 CD83，CD1a，CD86，CD80 和 HLADR 表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.802.13，3.961.15，12.336.75，19.6
9、38.12 和 39.447.9， 均低于对照组,但差异无统计学意义(P0.05);口腔癌患者来源的 DC 在体外具有诱导同种异体和自体外周血 T 细胞增殖的能力. 结论： 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟 DC，该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.【关键词】 口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖0 引言目前，对口腔癌的治疗手段仍以手术为主，由于颌面部能提供的切除面积有限，有时很难实现距肿瘤边缘 1.5 cm 清除病灶，而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康. 因此，如何缩小手术范围、有效控制临近亚病灶及微小病灶的发展是亟待解决的问题. 树突状细胞（dend
10、ritic cells, DC）是已知功能最强的抗原提呈细胞，并被认为是抗肿瘤免疫治疗的一种非常有前途的方法1-3，由于 DC 对 T 细胞的活化受 MHC 限制，故临床应用的 DC 细胞及其疫苗必须使用肿瘤患者自身来源的 DC，那么从肿瘤患者的外周血单个核细胞中能否经过体外诱导产生出功能性 DC，口腔癌患者与健康人 DC细胞的表型及其抗原提呈分子的表达以及刺激淋巴细胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在为临床以 DC 为基础的免疫治疗提供实验依据.1 材料和方法1.1 材料 RPMI 培养基(Hyclone USA), 淋巴细胞分离液(上海恒生公司 ), 重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGM
11、CSF),重组人白细胞介素 4 (rhIL4), 肿瘤坏死因子 (TNF)均使用美国 Peprotech Asia 公司产品. 取200505/200510 来我院口腔科住院治疗的口腔癌患者 15 例作为实验组，本组病例均经术后病理证实；对照组为健康志愿者 15 例. 两组人员均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.1.2 方法无菌采集外周血 50 mL，肝素钠抗凝. 加入等量无钙镁 DHanks 缓冲液（pH 7.4），充分混匀. 取 50 mL 离心管加入 Ficoll 淋巴细胞分离液 20 mL 后，再沿壁小心加入上述稀释的外周血 20 mL，2000 r/min， 20 min 离
12、心，分离外周血单个核细胞. 小心吸取中间层细胞，用 DHanks 洗涤细胞 3 次，弃上清，用含 100 mL/L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度为 11010 个/L，接种于 6 孔培养板，每孔 3 mL. 于 50 mL/L CO2,37条件下孵育 23 h后，吸出培养上清和非贴壁细胞（用于其它实验），用预热 37的培养基清洗板 1 次，以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，加入含 1 MU/L rhGMCSF和 0.5 MU/L rhIL4 的 RPMI 1640 完全培养基于 37 50 mL/L CO2 进行培养，孵育至第 5 日时，每孔加入 TNF 0.2 MU
13、/L, 7 d 后得到成熟的 DC4. 诱导培养 1，3，5，7 d 时用倒置显微镜观察细胞的形态变化及 DC 形成，在培养的 7 d 收集 DC，调细胞密度为 1107/L，分为两份，一份用 10 g/L 戊二醛固定 30 min,梯度乙醇脱水，叔丁醇干燥，喷金，扫描电镜观察细胞形态. 另一份用 25 g/L 戊二醛固定， 锇酸后固定， 醋酸钠、 柠檬酸铅双重染色， 透射电镜观察细胞超微结构.1.2.1FACS 测定细胞表型收集体外培养 5，7 和 10 d 的外周血单个核细胞，台盼蓝染色，确定细胞活力在 95%以上，分别加入直标荧光的，如 PE 标记的CD1a,CD86,HLADR,IgG
14、1（对照），FITC 标记的 CD83,CD80,IgG2（对照），充分均匀染色(4, 避光, 30 min)后 FACS 行细胞表型检测.1.2.2 混合淋巴细胞反应非贴壁细胞调整密度为 2109/L，加入 96 孔培养板中，分别按 101, 201 和 401 的比例加入上述培养的两组 DC（保持 T细胞数为 105），该 DC 先用 25 mg/L 丝裂霉素于 37孵育 45 min，然后调整细胞密度为 2108/L，加入培养板各孔内，总体积 200 L/孔，各实验组分设3 复孔，混匀，同时设对照组. 37，50 mL/L CO2 培养 72 h. 于实验培养终止前 4 h，加入 MTT
15、 液（5 g/L） 20 L/孔，混匀，继续培养 4 h，离心培养板（1000 r/min, 5 min），弃上清，每孔加入 DMSO（二甲基亚砜） 150 L，充分混匀，静置数分钟，检测每孔 490 nm 的 A 值，计算细胞培养指数5. 增殖指数（SI）=试验孔 A 均值/对照孔 A 均值.统计学处理： 采用 SPSS11.0 软件包进行统计分析; 两组样本均数的比较用 t 检验，多样本均数比较用方差分析, P0.05);实验组 DC 细胞的 CD83,CD1a,CD86,CD80 和 HLADR 表达的平均荧光指数(MFI)虽然均低于对照组,但差异无统计学意义(P0.05,表 1）.表
16、1 口腔癌患者外周血 DC 表面分子的表达比较（略）2.3DC 对淋巴细胞增殖反应的影响在自体和同种异体淋巴细胞反应体系中，随着 DC 比例增加，实验组和对照组淋巴细胞增殖能力均明显增强，实验组自体AMLR 增殖均值由 1.8 升至 3.2，健康人自体 AMLR 增殖均值由 2.2 升至 4.1，差异有统计学意义（P0.05）. 实验组 DC 与健康人 DC 在同种细胞比例下，对淋巴细胞的促增殖能力无统计学差异（图 2）.图 2DC 对 T 细胞增殖的影响略3 讨论近年来，对实体瘤的免疫生物治疗称为肿瘤防治的研究热点，免疫防御机制用于头颈部癌的治疗已显示较好疗效6，而 DC 作为体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC）,能刺激未致敏 T 细胞的增殖和活化、启动机体的特异性免疫应答，在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用. 人体内 DC 大多处于不成熟状态，激活淋巴细胞反应的能力较低，但具有极强的抗原内吞能力. 在摄取抗原或接受
