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1、膜片钳技术与应用 重庆医科大学儿童医院儿研所 陈恒胜,第一部分：膜片钳基础及原理 第二部分：膜片钳实验系统组成 第三部分：膜片钳实验基础 第四部分：膜片钳的应用,细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。,离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进
2、出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.,如何研究离子通道 对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方面进行研究 1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法确定其三维立体结构。 2. 功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。 3.结构和功
3、能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。,离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得阿格雷和罗德里克麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的离子通道药理学和Hill的 Ionic Channels Of Excitable Membranes . .,离子通道功能观察的两种技术 对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通
4、道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术,电压钳技术(Voltage Clamp)： 电压钳技术，是20世纪初由Cole发明， Hodgkin和Huxley完善，其设计的主要目的是为了证明动作电位的产生机制，即动作电位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，如膜的Na电导GNa与电化学驱动力（Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa= INa/ （Em-ENa).因此可通过测量
5、膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和Huxley在半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na, k ,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。,cole,K+电流,Na+电流,电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜
6、电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使VmVc, Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向
7、相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。,指令电位（Vc),+,_,Vo,电位记录电极 （Vm),电流注入电极 (I),电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点： 1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性； 2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。 3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在1030m之间)进行电压钳实验，技术上有更大的
8、困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是608OM或120150M（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1s）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力,膜片钳（Patch Clamp)：在利用电压钳观测了动作电位期间膜电导的变化之后，人们一直想搞清楚膜电导变化的机制，当时的实验证明，离子的跨膜流动的速度很快，膜电导又具有离子选择性，并可被某些药物特异性地阻断，这些现象提示离子可能是通过一些专一性的“孔道”样结构通过细
9、胞膜的，于是提出了“离子通道”的假设。为了证实离子通道的存在，也为了克服电压钳的缺点，Erwin Neher和 Bert Sakmann在电压钳的基础上发明了膜片钳（patch clamp）。并利用该技术首次在蛙肌膜上记录到PA级(10-12A)的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证明了离子通道的存在.并证明在完整细胞膜上记录到的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术的问世，给细胞生物学的研究带来了一场革命，被誉为与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人因此而获得诺贝尔生理或医学奖。,(Neher),(Sakmann),膜片钳是从Patch Clamp的翻译，Patch是小片，小块的意思
10、，这里指膜片，这个膜片可大可小，大到整个细胞膜，小到细胞膜上的一平方微米，Clamp是钳，夹的意思，这里指固定，钳制的意思，指通过将patch上的膜电位人为地控制在某一水平，或从一个水平瞬间跃迁到另一水平，从而记录patch上的单个离子通道或整个细胞膜上某一种类的离子通道的电流，从而通过记录离子通道电流来反映离子通道的功能,膜片钳（Patch Clamp)的基本原理： 利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅
11、为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。从而将电生理学技术提高到记录和研究单个蛋白质的分子水平,核心部分是一场效应管运算放大器构成的I-V转换器，他的正负输入端子为等电位。向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，从而达到电位钳制的目的。离子通道电流可作为I-V转换器内的高阻抗反馈电阻的电压降而被检测出。,根据实验要求，可组建不同的实验系统。但也有一些共同的基本组成部件，其中包括 电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。 光学部件和光电接口：显微镜；监视器等。 机械系统:防震台等。 辅助系统：电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等,第二部分
12、:膜片钳实验系统组成,电子学部件：由于膜片钳检测的是PA级的微电流信号，因此需要特殊的放大器及模数转换器，目前国内使用的主流放大器主要是美国AXON公司的200B和Multiclamp700B放大器及德国HEKA公司的EPC10放大器。 200B是电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳，Multiclamp700B和EPC10可通过软件进行操作，自动化程度高。,200B,MDC(原Axon)公司,MultiClamp700B,光学部件和光电接口：膜片钳实验是一个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃电极和细胞的封接，因此需要高质量的显微镜和成像系统，如果所用的细胞是培养的单个细胞，需要一台倒置
13、相差显微镜，而如果所用的标本是脑片或其他组织片，所用的光学系统必须是红外微分干涉差成像系统，这样才能“看”到组织中的单个的细胞，才能在可视条件下进行组织膜片钳的操作。,机械系统:由于膜片钳实验是一个微电和微操作实验，任何微小的震动都会影响电极和细胞的封接，导致实验的失败，因此一台高质量的防震台是必须的。,辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合性的集成系统，除了上面提到的几大系统外，相关的辅助系统也是必不可少的，辅助系统的设备好坏，很大程度上左右着实验能否顺利开展，有的实验室主要系统配置十分主流，而辅助系统则凑合，这将极大的影响实验，所谓细节决定成败，用在膜片钳实验中是十分贴切的。,Sutter公司
14、微电极拉制器,P-97,P-2000,日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪,软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处理软件，如Origin等软件。,MDC公司Pclamp采集和分析软件,第三部分：膜片钳实验基础 前面两部分介绍了膜片钳技术的原理及膜片钳的系统组成，在此基础上本部分简要介绍： 膜片钳放大器的工作模式 膜片钳的记录方式 膜片钳实验基本过程 膜片钳记录的信息,膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是
15、诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是膜片钳的基本工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入刺激电流，记录膜电位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，EPSP;IPSP等电压信号。,细胞贴附式,全细胞记录式,外面向外式,内面向外式,膜片钳的几种记录模式极其形成：,各种记录模式的形成过程,各种记录方式的用途及其优缺点：,膜片钳实验的基本过程： 1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。 2.标本制备 3.记录 4、资料分析： （1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子
16、选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发（Burst）样开放与闪动样短暂关闭（flickering），化学门控性通道的开、关速率常数等。（3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。（4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最后结论。,a,膜片钳使用的标本 1.单细胞：急性分散细胞和培养细胞 2.脑片或组织块。 3.整体动物。 要求：膜片钳80%的工夫在于制备细胞。细胞表面要干净,不能有胶质细胞等蛋白质物质。细胞状态良好，表面光滑，无麻斑，无肿胀或皱缩。,脑片,单细胞,膜片钳记录的信息,电压钳模式,电流钳模式,1.单通道电流,1.典型的单通道电流呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。他有两个电导水平，即0和1，分别对应通道的关闭和开放状态。 2.有的矩形脉冲簇状发放时，通道电流不在同一水平，可以明显观察到不同数目离子通
