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1、新型卵巢癌标记物HE4 的研究进展,崔 恒 北京大学人民医院 妇科肿瘤中心,世界范围统计资料,癌 新发 死亡 宫颈 470,000 230,000 卵巢 190,000 114,000 内膜 188,000 45,000,美国2008,卵巢癌的现状,一个难题：无成熟的早期诊断方法； 二个70%：确诊时约70%已属晚期；治疗后即使是已达到临床完全缓解的病人仍有70%最终将复发； 三个进展：手术病理分期、肿瘤细胞减灭术、紫杉醇+卡铂化疗方案 四个焦点：保留生育/生理功能、早期的辅助治疗、晚期的治疗、复发的诊断和治疗,卵巢癌的诊断策略- 早期诊断,卵巢癌的早期诊断一直是卵巢癌研究中最具挑战性的课题
2、肿瘤诊断的三大支柱 图像诊断：B超 CT、MRI PET/CT 血液与体液检测：肿瘤标记物 细胞学与组织学诊断,现阶段卵巢癌的诊断,目前常用的诊断方法包括：1）妇科三合诊；2）阴式彩色B超；3）血清CA125的检测；4）计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET或PET/CT）等,关于诊断正在研究中的有： 放射免疫显像（RII） 新的或多种血清标记物的检测 血清中卵巢癌特异抗体的检测 恶性肿瘤危险指数评分（RMI) 癌基因和抗癌基因突变的检测，特别是与遗传相关基因的检测（芯片） 发现和寻找新的特异抗原和基因,肿瘤标记物的定义,与肿瘤相关的抗原或某种生物活性物质 肿
3、瘤细胞异常表达 反映癌变发生、发展过程 可被检出,有效的肿瘤标记物,特异性强 敏感性高 交叉反应小 早期诊断率高 随病情变化监测值变化明显,临床应用,肿瘤诊断及鉴别诊断 肿瘤残存 复发的预测及复发部位监测 疗效观察及预后评估 对无症状早期癌及高危人群的筛查,血清肿瘤标志物的检测,CA125是应用最多的卵巢癌血清肿瘤标志物，特别是最常用的监测卵巢癌复发的指标。 期卵巢癌患者仅有约30-50% 35u/ml，监测复发的敏感性、特异性、阳性预测值分别为79、95、100。 1健康妇女、3良性卵巢肿瘤、6非卵巢相关的良性疾病可有血清CA125水平升高。在子宫内膜异位症、盆腔结核、炎症等甚至高达50-7
4、0%,卵巢癌相关的其它标志物,基因分析和组织化学分析已发现许多新的可能与卵巢癌相关的标志物 MUC1 Kallikreins：hK4, hK6, hK8, hK10 Mesothelin Antileukoproteinase 1 (ALP1) Osteopontin VEGF S100A1 Inhibin LPA B7-H4 HE4，表达上调在卵巢癌中最常见，且在早、晚期患者中mRNA和蛋白的表达均上调。,HE4,HE4 （Human Epididymis Secretory Protein 4,人附睾分泌蛋白4） 1991年由Kirchhoff等从人的附睾中克隆出cDNA，基因定位在染色体
5、 20q12-q13.1，全长为12kb左右，由5个外显子和4个内含子组成，编码的蛋白质与细胞外蛋白酶抑制剂有很高的同源性，是一种酸性蛋白质。 1999年Schummer等发现HE4 mRNA在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中 不表达。HE4在恶性肿瘤中的高表达多见于卵巢癌、子宫内膜癌，少见于肺腺癌及间皮瘤。,HE4在早期（I期）的卵巢癌中的敏感性及检测卵巢癌总的敏感性均高于CA125，是卵巢癌敏感及特异的标志物，可用于对卵巢癌的早期诊断及辅助监控卵巢癌患者的治疗情况。 英国的一项研究对200，000妇女用30多种肿瘤标记物分别单独或与CA125联合进行卵巢癌筛查，HE4可以使诊断卵巢癌的敏
6、感度和特异度提高,Biochemistry of HE4,HE4 - Human Epidiymis secretory protein 4 Member of the WAP-gene family of protease inhibitors (new name WFDC-gene family) Characterized by an approx 50 aa sequence with 8 highly conserved cysteine residues that form 4 disulphide bridges. WFDC (Whey Acidic Protein Four D
7、isulphide Core) Tumour associated WFDC-proteins ALP1, Elafin, HE4 (WFDC2), PS20 (WFDC1),HE4 mRNA expression profile,Restricted expression profile in normal tissue Expressed in normal epididymis, and epithelia of the respiratory and reproductive tract Tumor-restricted expression in ovarian cancer 90
8、% of serous ovarian cancer HE4 mRNA highly expressed in lung adenocarcinomas 60 % high expression in AdC 10 % high expression in SqC,From Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 847 - 853,Expression of HE4 mRNA in cancer,HE4 antigen expression in Ovarian cancer,Galgano et al Modern Pathol (2006)19; 84
9、7 - 853,HE4 antigen is highly expressed in serous, endometroid and clear cell ovarian cancer Mucinous, germ cell or sex cord ovarian cancer barely express HE4,Drapkin et al Cancer Res (2005) 65;2162-2169,HE4 是一种适宜的卵巢癌血清标志物,HE4 可分泌入体液 正常卵巢不表达，而在卵巢癌高表达-特异性好 在早期和晚期HE4表达均呈高度上调 早期病例具有高度敏感性 HE4的表达独立于CA125
10、的表达 联合检测将较各自单独检测获得更 多的信息,HE4诊断试剂盒,HE4 EIA试剂盒由瑞典Fujirebio Diagnostics AB公司生产，已经获得了FDA认证和CE认证，在美国、欧洲等多个国家上市销售，现正在申请在中国上市注册。 Fujirebio Diagnostics AB公司研制的HE4 EIA试剂是国外唯一用于定量检测人血清中HE4的试剂，国内尚无任何检测HE4的试剂上市销售。,HE4 EIA 方法的建立,主要试剂： 2H5 and 3D8 MAb established using HE4-Mouse Ig fusion protein as immunogen Hel
11、lstrom et al, Cancer Research 63, 3695 3700, 2003 检测原理： Two-step forward sandwich immunoassay based on Bio 2H5 MAb for catching of HE4 and HRP 3D8 MAb for detection,HE4 用于监测卵巢癌,约 80%患者HE4与CA125相符，与病情一致,Study on 80 patients, 4,4 observations/patient Measured concordance between biomarker change & cli
12、nical status Compared HE4 and CA125,HE4 在卵巢癌的动态监测中与CA125具有良好的互补性,Conclusion: HE4 and CA 125 show equivalent but complementary performance for monitoring of ovarian cancer,HE4 EIA中国注册临床试验总结 瑞典康乃格公司市场部 2009年3月,临床研究方案,样本量及样本量确定的依据 根据国食药监械2007240号发布的体外诊断试剂临床研究技术指导原则（以下简称“临床导则”），HE4 EIA属于进口三类体外诊断试剂。 临床导则
13、要求临床验证至少要在三家省级以上医院进行实施，总样本数不少于1000人份。,样本选择依据 HE4 EIA试剂属于国内首次申请注册的用于定量检测患者血清中的HE4浓度，可用于上皮性卵巢癌患者的辅助诊断和疗效监测。因此，临床试验收集的血清样本包括： 上皮性卵巢癌样本、盆腔包块疑似样本、正常健康人样本、其他肿瘤样本、良性疾病样本及干扰样本等。同时包括临床收集的跟踪样本。,入选标准：不同样本组收集的血清，要求知道当前受试者的临床诊断。收集的血清样本要求足够用于试剂盒的检测。 样本收集：根据样本要求，医院收集常规的血清样本，要求标记清楚。 样本保存：血清样本在2-8条件下可以保存3天，或者 - 40下长
14、期保存。 样本运输：血清样本的运输需要在2-8条件下进行，样本的使用不能超过限定时间。所有人体来源的样本必须按照国家和国际的运输规章运送。,金标准的确立：临床采用病理检测结果作为卵巢癌诊断的金标准。 质量控制方法： 严格按照产品的说明书要求进行操作，要求质控品C1和C2结果在标示范围内； 严格执行编盲的原则，避免主观判断影响产品的检测结果； 产品检测过程中，为了避免人为试验误差，在产品解盲后，如果研究试剂和金标准结果不一致，要求进行重复测定。,临床研究观察指标 CUT-OFF值 汇总正常健康女性样本的检测结果，给出P95结果作为CUT-OFF值。参考试剂盒提供的CUT-OFF值，对中国健康人群
15、的CUT-OFF值进行评价。 灵敏度、特异性、总符合率、阳性预期值和阴性预期值。 临床疗效监测 将浓度变化和病程发展汇总到 2x2 表格中，分析HE4在疗效跟踪上的有效性。 临床试验中的精密度、重复性的检测。,多中心临床研究,检测样本分布,中国人群CUT-OFF值的评价,临床检测正常健康人群样本363例，HE4浓度检测值范围为：22.8-106.0pM 73.7pM：中国健康人组（P95）的参考值。 150pM：试剂盒提供的参考值。,各中心健康人CUT-OFF值的评价,各分中心评价中国健康人群的CUT-OFF值基本一致，可以选择73.7pM作为中国 正常健康人群的参考范围。,不同的CUTOFF
16、值 对卵巢恶性肿瘤的诊断能力,结论： 以73.7 pM作为CUT-OFF值时，可以大大提高对上皮性卵巢癌病人的诊断率，避免漏检。 以150 pM作为CUT-OFF值时，HE4在健康人群及良性疾患等对照组中的具高特异性，能有效的鉴别诊断卵巢良、恶性肿瘤，为临床上皮性卵巢癌的辅助诊断提供有力帮助。,入组患者血清HE4水平分布,说明：在干扰样本中，提示高胆红素可能对HE4的检测有干扰，与国外研究结果 一致。,HE4在卵巢癌恶性肿瘤中的 动态监测的评价,动态监测HE4浓度变化要求： 为了避免试剂检测中存在的偏差，选择2.5倍的最大精密度(CV)作为HE4浓度变化的指标。HE4的阳性变化（阳转）/阴性变化（阴转）为当前结果比前一测试结果的测定值升高或者降低至少2.5倍最大CV。 动态监测样本： 多中心临床动态监测评价，共收集34例上皮性卵巢癌患者的64份血清。 32例患者同时收集了术前、术后样本。 2例患者动态监测均为术后样本
