微生物学实验3-11-cm

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1、实验3 实验室环境及人体表面微生物的检查分离,目的要求,1.证实实验室环境与人体表明存在微生物。 2.体会无菌操作的重要性。 3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。 4.无菌操作，将分离的典型菌落划线培养于固体斜面。,原理,通过培养的方法使 肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。,操作步骤,1.做好标记,2.不同样品采集,3.平板倒扣37或室温培养,a,b,c,d,请注意无菌操作,思考题,体会,实验报告,根据p8表格填写实验报告。,实验4 显微镜的使用及细菌的简单染色法,p43,6. 双眼同时睁开观察，减少眼睛疲劳，且可同时画图和记录。 7.

2、 可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触碰样品处 8. 双眼聚焦于同一个视野。,油镜使用,待后面演示,简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构 造。,用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是

3、前两者的结合物又称复合染料如伊红美蓝、伊红天青等。,三、实验材料,奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜） 同学们分离纯化培养的不同菌株 草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。,（一）、制作细菌观察片（单染色）,（1）涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm2。 （2）干燥将涂片于室温中自然干燥。 （3）固定手执载片端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上

4、烤，否则细菌形态毁坏。,（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。 （5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。 （6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。,一,二甲苯有毒，同学请注意安全，且会腐蚀镜头，不宜使用过多,注意事项,1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多（1小黄豆），挑菌量宜适中，菌膜宜薄，切忌过厚（不要来回涂抹）。 2在染色过程中，不可使染液干涸。

5、3. 无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。 4.涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（3-6次）,问题和思考,1涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 4.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,五、实验报告,(一)绘图（细菌形态图）P46 (二)单染色法操作要点。,实验4 革兰氏染色法 荚膜染色,一、实验目的,目的： 1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术; 2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法； 3.掌握染色原理。,二、原理,革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(

6、G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,金黄色葡萄球菌革兰氏染色图,大肠杆菌革兰氏染色图,革兰氏染色的实际

7、意义 (1)鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定. (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感度不一.例如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考. (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为,荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。 细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采用负染色法

8、染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。,荚膜功能： 抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。 粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重要因素。 抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤，如溶菌酶、补体等。 抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在95%以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。,形成条件： 荚膜的形成与环境条件密切相关。

9、一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失。,三、实验材料,革兰氏染色： （1） 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大 肠杆菌（E.coli）斜面； （2） 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95乙醇、石炭酸复红液等)、 （3） 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种 环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,四、实验步骤,菌体适中，玻璃涂成薄膜，不宜太厚，用后接种环用火焰灭菌。,制作涂片,晾干，易于染色,固定，强度适中，不宜烫手,初染,1-2min，所有染色过程染液不可干涸,水洗至无色,媒染,先冲去残留水，媒染1min

10、，水洗并沥干,脱色,脱色至流出液为无色，一般20-30s-1min，水洗并沥干。整个过程不要靠近火焰。,复染,1-2min，所有染色过程染液不可干涸,water,水洗，晾干，镜检。,注意事项,1、染料避免干涸，酒精脱色务必避开火焰。 2、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现变化），造成假阳性。一般选用生长活跃的菌体进行染色。（18h-32h） 3、涂片过厚或菌悬液过浓，导致细胞大量堆积，容易导致脱色不完全，造成假阳性。染色结果以分散良好的细菌染色结果为准。 4、酒精脱色不够导致假阳性，脱色过渡导致假阴性。 5、控制好染色区域，保证整个染色过程及最后镜检在同一个区域进行，可用铅笔标记 。,思考题,

11、可用什么方法证明革兰氏染色是成功的？（混合涂片） 革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？ 革兰氏染色哪一步最关键？,五、实验内容及结果,大肠菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，并记录染色结果（颜色，G+或G-）及放大倍数（包括物镜及目镜）。,荚膜染色,实验材料： (l)生技术班同学培养的一株细菌（SJJM） (2) 石炭酸复红染色液、黑色液（墨汁）。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。,实验步骤,1制片：在干净载玻片一端滴一滴无菌水，取少许细菌在水滴中制成悬液。取一小滴新配好的黑色素溶液（也可用墨汁）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整

12、的边缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 2固定：用纯甲醇固定1分钟，立即倾去甲醇，自然晾干。 3染色：加结晶紫/番红/碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片上，染1-2min，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。 4. 油镜观察结果。 先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清晰透明圈。,注意事项,1、玻片干净无油脂。 2、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。 3、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有较强的毒性，对人体的神经系统和血液系统影响最大 ，请同学使用过程特别留意。,思考题,1、荚膜染色，为什么不能热固定？ 2、荚膜负染法，荚膜为何

13、不着色而菌体着色？ 3、在荚膜Anthony氏染色法中，硫酸铜溶液的作用是什么？,实验内容及结果,菌株SJJM 荚膜染色，绘图，记录染色结果（菌体及荚膜形态）及放大倍数（包括物镜及目镜）。,球菌：SJJM菌株光学显微镜图（简单染色） 放大倍数：1000倍,存在的其他问题：细菌形态不规则，菌体有缺口，多种形态细菌混杂而未标注。,实验5 细菌芽孢和鞭毛染色,一、实验目的,目的： 1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术; 2.学习并掌握细菌芽孢和鞭毛的染色方法及染色原理； 3.了解细菌芽孢和鞭毛的形态特征。,细菌芽孢染色,芽孢是菌种分类鉴定的重要指标，在菌落形态上也有其相关特征。形成芽孢的细菌菌落表面

14、一般为粗糙不透明，常呈现褶皱,枯草芽孢杆菌菌落,1 背景知识,有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的圆形、椭圆形或圆柱形的休眠体。 1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端 。 在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌。 产芽孢的细菌多为杆菌，在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢。,1背景知识,芽孢的形成过

15、程,1背景知识,芽 孢 的 结 构,1背景知识,2染色 原 理,染色特性：芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。一旦着色，又难以被水洗脱。,解决办法：一般采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都同时染上色后，再用脱色剂冲洗，脱去菌体的颜色，但仍保留芽孢的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色（复染），如此可以在显微镜下明显区分芽孢和营养体的形态。 通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水冲洗掉，而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一种呈红色的

16、碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同颜色。,3 实 验 材 料,仪器及器材：显微镜、酒精灯、试管夹、接种环 载玻片、镊子、洗瓶、吸水纸、擦净纸。,试剂：5%孔雀石绿、0.5%番红复染液、 香柏油、二甲苯,菌种： LB斜面上培养2448小时枯草芽孢杆菌和SGLL菌株斜面。,4 染色步骤,菌悬液、涂片、干燥、固定,3-5滴,充分水洗,充分水洗,染色结果：芽孢绿色，菌体红色。,16h,48h,16-48h之间,枯草杆菌石炭酸复红 染色图片,枯草杆菌吕氏美蓝 染色图片,5 注意事项,1.选用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌 已形成芽孢囊为宜，取菌适中。 2.涂片要薄，且固定时的温度控制好； 3.加热染色要用微火，加热过程中要及时补充染液，切勿让染液干涸； 4.染色时间的掌握； 5.水洗时水流不能急，不能冲有菌的一边；6.孔雀石绿 有高度毒性.,思考题,芽孢染色为什么要