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1、1,色谱分离法,参考 生物大分子的液相色谱制备 第二版，师治贤编著，科学出版社 生物工程下游技术细胞培养、分离纯化，分析检测，刘国诠编，化学工业出版社，1993,2,各类色谱中溶质与固定相间的相互作用力,3, 色析法的发展过程：,圆形滤纸,长条滤纸,薄层层析 (TLC),管柱层析,容量变大,容量更大,加展开液,Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.9,Paper partition chromatography (PPC),Martin, Synge (1952),4, 色层分析法
2、的基本机制：,极性相似的两分子间，其亲和力较强。,极性 极性 非极性 非极性,Like Dissolves Like,5, 色层分析法的基本原理：,样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一,ADSORPTION,PARTITION,Liquid - Solid,Liquid - Liquid,B,C,每次分离样本 都要做一次选择,One Plate of Separation,(理论板数),极 性,非 极 性,极 性,非 极 性,6,.凝胶过滤色谱 GFC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法 填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。,7, 凝胶过
3、滤法是一种 Partition 层析法：,样本,固 定 相,流 动 相,小分子 被阻滞,小分子,大分子,Stokes radius 分子大小、 形状,较快流出,8, 各 种 色 析 胶体 ：,Pharmacia,Bio-Rad,Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel,BioGel P BioGel A,glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose,acrylamide agarose,FPLC,Superose, Superdex Mono Q, Mono S,9,传统SEC填料 粗、中、
4、细 Sephadex葡聚糖凝胶（瑞典 Pharmacia 公司Amersham） 肽和球蛋白的分离范围 G10 -700 G15 -1500 G25 10005000 G50 150030000 G75 300080000 G100 4000150000 超细4000100000 G150 5000300000 超细5000150000 G200 5000600000 超细5000250000,10,Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与N、N-亚甲基双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联的刚性珠体。 S-200 5000250,000 S300/400/500/1000 Sepharose琼脂糖
5、凝胶2B/4B/6B Sepharose CL交联琼脂糖 琼脂糖与2，3-二溴丙醇在强碱性条件下反应而得。,11,Bio-Gel Bio Rad(美) Bio-Gel A 琼脂糖 P聚丙烯酰胺 Superdex 琼脂糖和葡聚糖 TSK-Gel乙烯共聚物 PW2000/2500/3000/4000/5000 TSK HW-40/50/55/65/75 TSK G4000/3000/2000SW 凝胶过滤色谱一般用于原料液的初分离,12, 胶体过滤法的胶粒：,13, 胶柱的装填方法：,缓 冲 液 平 衡,温 度 平 衡,静 置 胶 体,清 洗 胶 体,预 估 体 积,装 填 胶 体,暂 停 流 洗
6、,X,继 续 流 洗,加上 reservoir,已 堆 积,沉 积 中,上 清,加 压 流 洗,加上 adaptor,紧 密 堆 积,检 查 好 管 柱 是 否 畅 通,1 2,Gel,14,装置示意图,15,16,17,凝胶过滤色谱图,18,凝胶过滤色谱标准曲线,19,酶分离纯化的方案设计,The following information is known about four proteins:,20,a. Sketch the elution profile expected if this mixture is run on a Sephadex G-100 gel filtrati
7、on column run in 50 mM phosphate buffer, pH 6. Label the peaks. b. Sketch the gel obtained from running these proteins on an SDS polyacrylamide electrophoresis gel at pH 8.0, (after staining and destaining). c. What predictions can you make about the results of a native PAGE at pH 7.6 ( state any assumptions you might need to make about the % acrylamide in the gel ),21,d. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks.,
