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1、医学论文-冠心病痰瘀证与载脂蛋白 E 基因多态性关系的研究作者：欧阳涛，宋剑南，苗阳，林谦，牛晓红 ，金红，陈冰【关键词】 ,冠心病摘要 目的：探讨冠心病（coronary heart disease, CHD）不同痰瘀证候与载脂蛋白 E（apolipoprotein E, ApoE）基因第 4 外显子多态性的关系。方法：选择符合条件的 CHD 痰证、瘀证、痰瘀互阻证和非痰非瘀证（其它证型）患者 200 例，另选 100 名健康志愿者作为对照。常规检测所有样品的血脂水平。提取全血 DNA，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestrictio
2、n fragment length polymorphism, PCRRFLP）技术检测ApoE 基因型。采用 SAS 软件对基因多态性和痰瘀证候的辨证类型进行相关性分析。结果：（1）冠心病患者中 4 等位基因频率（19.5%）明显高于健康对照组（9.5%），具有统计学意义（P0.05），其中尤以 E 3/4 基因型更为多见（P0.01）。（2）携带 4 等位基因者的总胆固醇（total cholesterol, TC）、总甘油三酯（total triglycerides, TG）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）水平明显高
3、于非携带者（P0.01）。（3）痰证特别是 E3/4 基因型患者中 E3/4 型和 4 等位基因的频率明显高于血瘀证患者（P0.05）。结论：ApoE 4 等位基因是冠心病的危险因素，携带此基因的患者与痰证关系较为密切，推测其可能是 CHD 痰证的主要易感基因之一。关键词 冠心病; 载脂蛋白 E 类; 基因多态性; 痰瘀证候Study on relationship between polymorphism of apolipoprotein E gene and syndromes of phlegm and blood stasis in patients with coronary he
4、art disease ABSTRACT Objective: To explore the relationship between polymorphism of apolipoprotein E (ApoE) exon 4 gene and different syndromes in patients with coronary heart disease (CHD). Methods: Two hundred patients with CHD were divided into four groups according to syndrome differentiation, i
5、ncluding syndrome of phlegm (PS), syndrome of blood stasis (BSS), syndrome of phlegmblood stasis blocking (PBBS) and syndrome of nonphlegm and nonblood stasis (NPNBS). One hundred healthy volunteers were included in control group. Blood lipids were measured by routine examination. Total DNA of perip
6、heral blood was extracted. ApoE genotypes were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) technique. All data were analyzed by SAS software. Results: (1)The occurrence rate of 4 allele of ApoE in patients with CHD was 19.5%, significantly higher than 9.
7、5% in the control group (P0.05), and the E 3/4 genotype was especially more frequent (P0.01). (2) The levels of total cholesterol (TC), total triglycerides (TG) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDLC) in patients with 4 were higher than those in patients without 4 (P0.01). (3) The frequencies
8、of 4 allele and E3/4 genotype in patients with PS were significantly higher than those in patients with BSS (P0.05). Conclusion: ApoE 4 allele, especially E3/4 genotype, is the risk factor of CHD. There is a relatively close relationship between patients with ApoE 4 allele and PS. It may be one of t
9、he main susceptible genes in CHD patients with PS.KEY WORDS coronary heart disease; apolipoprotein E; gene polymorphism; syndrome of phlegm and blood stasis 载脂蛋白 E（apolipoprotein E, ApoE）作为脂蛋白的组成部分和功能蛋白，对血脂代谢起调节作用, 编码 ApoE 基因的变异是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一。已有报道证实：不同遗传背景人群的 ApoE 的基因多态性通过影响脂质代谢而与冠心病(coronary h
10、eart disease, CHD)的发病密切相关13。证候是中医认识和治疗疾病的根本，冠心病患者的临床表现以血瘀证和痰瘀互阻证为多见4。本研究对冠心病不同证候的发生和 ApoE 基因多态性的相关性进行了探讨，现报道如下。1 资料与方法1.1 病例纳入标准 选择在北京西苑医院和北京东方医院就诊的心肌梗死患者、或经冠状动脉造影及介入治疗确诊为冠心病的患者，这些患者均符合1999 年美国心脏病协会 AHA/WHO 公布的冠心病分型和诊断标准5。然后对这些患者进行中医辨证确定证候类型。痰证、血瘀证、痰瘀互阻证、气虚证、阳虚证、阴虚证、气滞证、寒凝证等参考国家技术监督局发布的中医临床诊疗术语证候部分（
11、国家标准 GB/T16751.21997）。1.2 病例排除标准 半年内曾有严重创伤或重大手术者；肾病综合征，甲状腺功能减退症，急性肝胆疾病及糖尿病患者；服用药物影响血脂代谢的患者；正在使用影响血脂代谢药物的患者。1.3 病例资料 按上述标准纳入不同证候类型的冠心病患者共 200 例，其中男 105 例，女 95 例；平均年龄(63.65.8)岁；其中痰证 20 例（10%），瘀证 79 例（39.5%），痰瘀互阻证 82 例（41%），非痰非瘀证 19 例（9.5%）；身体质量指数（body mass index, BMI）为 15.134.3 kg/m2。另选 100 名健康体检者作为对照
12、组，其中男 55 名，女 45 名；平均年龄(62.17.8)岁；均无冠心病症状，常规心电图及超声心动图检查正常。以上样本人群均来自北京和河北地区，汉族，无血缘关系。所有病例均作标准基线问卷调查，结果记录于按临床流行病学要求设计的表格上。医师、患者和实验研究人员之间实行盲法。1.4 材料1.4.1 主要试剂 血清总胆固醇（total cholesterol, TC）和总甘油三酯（total triglycerides, TG）测定试剂盒购自法国申能公司；高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensi
13、ty lipoprotein cholesterol, LDLC）测定试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；血脂测定多项质控物由卫生部临床检验中心提供；全血DNA 纯化试剂盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA 分子量 Marker（PCR Marker 和 pBR322Hae Marker）以及限制性内切酶 HhaI 均购自美国 Promega 公司；丙烯酰胺和 NN甲叉双丙烯酰胺，均购自北京鼎国生物技术公司。1.4.2 血样采集 患者空腹 12 h 后，静脉抽取 2 ml 血样，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取 D
14、NA。1.4.3 引物 根据 Richard 等6设计引物，序列为 P1：5AACAACTGACCCCGGTGGCG 3；P2：5 ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3，均由北京鼎国生物技术公司合成。1.5 方法1.5.1 血脂水平的测定 测定 TG 采用胆固醇氧化酶过氧化物酶 4 氨基安替比林和酚法；测定 TC 采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶过氧化物酶 4 氨基安替比林和酚法（GPOPAP 酶法）；测定 HDLC 采用选择性抑制法；测定 LDLC 采用选择性反应法。致动脉粥样硬化指数（atherogenic index, AI）的计算公式为：AI=（TCHDLC）/HDLC。1.5.
15、2 ApoE 基因型的测定 采用全血 DNA 纯化试剂盒提取全血 DNA。按现代心脏内科学5中的条件扩增 ApoE 基因的目的片段。反应体系：10倍缓冲液 2 l，浓度为 2 mmol/L 的 dNTPs 2 l，二甲基亚砜 2 l，浓度为 2 mol/L 的引物各 0.25 l，2 U Taq 酶，DNA 模板 100200 ng，总体积20 l。循环条件：95 预变性 8 min，然后 95 45 s、60 45 s、72 45 s，共 35 个循环后，72 延伸 8 min。经 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）检
16、验扩增结果。取 10 l PCR 产物加入 10 倍酶切缓冲液 2 l，小牛血清 0.2 l，浓度为 10 U/l 的HhaI 0.5l，去离子水 7.3 l。37 反应 4 h。产物用 15% PAGE 检测其基因型。1.5.3 样品测序 随机选取各基因型的 PCR 产物送北京鼎国生物技术公司进行序列测定。1.6 统计学方法 所有资料均采用 SAS 软件包进行分析。等位基因频率计算采用频率记数法；基因型，基因分布频率及基因和证候的相关性分析用 2检验。不同基因型之间血脂的均数比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 ApoE 基因目的片段 PCR 扩增结果 所有 300 例血样均获得了阳性扩增条带，目的片段分子量为 292 bp。见图 1。2.2 PCR 产物 HhaI 酶切分型结果 在 300 例样品中共检测出 6 种 ApoE
