动物繁殖调控技术

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1、动物繁殖调控技术,人为地调控动物的生殖活动，提高动物生产的效益和质量，使之适合于人们经济发展与维持生态平衡的需要，要求人们加速发展经济动物、观赏动物及保护,濒危动物，这些促进了畜牧兽医工作者对动物生殖进行有效了调控，充分发挥动物的生殖潜力，提高繁殖效率，使之进一步满足人民生活在社会发展的需求。,动物繁殖调控技术,动物繁殖调控技术主要包括： 人工授精技术（Artificial Insemination,AI) MOET技术（Multiplovulation and Embryo Transplant,超数排卵与胚胎移植） 胚胎体外生产技术（In vitro embryo production,I

2、VP) 相关延伸技术（胚胎冷冻、性别鉴定、胚胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植和基因导入等）,一、人工受精技术 （Artificial Insemination,AI）,1、历史研究 1780年，意大利Spallanzani首次用犬进行人工受精，获得成功; 1899年，俄国伊万诺夫进行马和牛的AI工作，将犬的假阴道改进成了马、牛、羊用假阴道，并研究精液处理方法，使AI技术进入实际应用阶段; 1951年，英国人Polge等将甘油用于-79超低温冷冻保存牛精液并输精，同年产下世界第一头冷冻精液牛犊; 1952年，Polge又发表了用经液氮在-192保存9个月鸡精液的受精卵孵化出了雏鸡的报告,一、人工受精

3、技术,2、人工授精技术（AI） AI是借助于器械或徒手操作，以人工和方法采集雄性动物精液，经过精液品质检查、稀释、保存和运输等一系列处理后，再送入到发情雌性动物的生殖道内以达到受胎的目的。这种代替自然交配的技术，称为AI技术。,一、人工受精技术,人工授精技术是由： 采精技术（包括采精技术和采精频度） 精液处理技术（包括精液品质检查、 稀释和保存） 输精技术（包括输精的准备、要求和 方法） 三部分组成。,一、人工受精技术,2.1采精技术 常用的采精方法是：假阴道法 此外还有按摩法与手握法。 采精频度是指每周对公畜的采精次数。 对公牛而言，2-3次/周是较合理的。,一、人工受精技术,2.2精液处理

4、技术 精液品质检查的内容有： 精液的感官检查 精子密度 精子活率 每头份有效精子数 精子畸形率 顶体完整率 精子存活时间及存活指数 伊红低渗溶液试验 细菌学检查,一、人工受精技术,精液稀释应在采出的精液经品质检查合格，湿度下降之前及时稀释。 AI操作规定每头份输精量中应含有效精子数为： 牛1000万-1200万 羊5000万-6000万 猪1.5亿-2.0亿,一、人工授精技术,液态精液的保存依保存温度可分为： 常温保存（15-25） 低温保存（0-5） 冷冻精液的保存温度为-196,一、人工授精技术,2.3输精技术 输精前的准备：凡是接触精液及母畜生殖道的器械使用之前均须洗涤干净并作消毒灭菌处

5、理。 精液的准备：用于输精的精液必须按常规进行品质检查，符合AI输精标准。 输精母畜的准备：经发情鉴定需要的母畜，一般均采用站立保定。 输精方法：牛一般采用直肠把握法，而羊均采用开膣器输精法。,一、人工授精技术,3、人工授精技术的发展前景 建立精液基因库 普及和研究各种动物的AI技术 冷冻精液的生产和使用应规范化 加强精液冷冻保存的基础研究,二、MOET技术 Multiple ovulation and Embryo Transfer 超数排卵与胚胎移,胚胎移植又称为受精卵移植，它的简单含义是：从一头母畜（供体）的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头母畜（受体）的输卵管或子宫。“借腹怀胎”

6、，以达到产生供体后代的目的。 基本过程包括:供体(donor)和受体(recipient)的选择、供体的超排处理及配种、受体同期发情处理、胚胎回收、检卵和移植。,二、MOET技术,历史研究：,二、MOET技术,1、供体和受体的选择 1.1供体的选择 首先要考虑其经济价值,只有具有高生产性能的牛才可做为供体 供体牛具有稳定的遗传能力,没有遗传疾病,繁殖机能 旺盛,体质健壮没有任何传染疾病,发情周期正常,发情症状明显,没有流产史和其它一些繁殖机能疾病。 年龄选择在15个月龄到10岁以内的供体牛,老龄、太肥、太瘦、长期空怀的母牛不能使用。两次超排处理反映不良的不能使用。 分娩6个月以内、3个月以上的

7、母牛繁殖机能旺盛,可以做为主要的供体牛选择对象。,二、MOET技术,1.2受体的选择 受体牛一般选用价格低廉的土种牛 拥有两个以上正常的发情周期,无繁殖疾病,体格健壮,耐病性良好,哺育犊牛能力强 体格标准,符合品种要求 分娩后60天以上的母牛。,二、MOET技术,2、供体的超排处理及配种 2.1供体的超排处理 (1)+法: 根据供体牛体重的大小,在发情后912天肌注25003500,48小时后肌注或宫注2,48小时后观察母牛发情情况,在发情后18小时肌注与等量的,并同时进行人工授精,时隔12小时再输精一次。缺点是供体牛个体反映变异范围较大。,二、MOET技术,(2)法:,二、MOET技术,2.

8、2人工授精 两次授精,以增加获得受精卵母细胞的机会。动物一般在停药后24-48h内有95%的母畜均表现发情。一般上、下午各输1次, 因母畜为超排处理.有多个卵子排出，而需加大输精量.用原精的0. 2 ml(含4亿精子)/次。如第二次授精时供体牛仍处于发情状态,则须在812h后再进行第三次授精。,二、MOET技术,3、受体同期发情处理 同期发情是利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。 当前常用的激素药物有PMSG、GnRH、LHRH、FSH、LH、hCG、PGF2、P4及类似物等。在牛上

9、常用二次PGF2,一般注射后36-48h,有45%60%母牛均表现发情。,二、MOET技术,4、胚胎的收集 目前在牛上常用非手术采集胚胎。用专用的二通或三通硅胶管制品前端有一气囊。冲气后阻止冲胚液流出。 冲胚液大多用杜氏磷酸缓冲液(PBS)加5% 一10%牛血清白蛋白(BSA)也有加TCM-199的组织培养液的。 胚胎采集方法以发情日为第0d,在第7d以手术子宫冲洗法采集胚胎。在此时期,胚胎朝向子宫推进。当冲胚时,将特地配制的冲卵液经导管注入子宫,如此则子宫内的胚胎都集合于冲胚液中,随后再导出于贮液器内,并保存在37条件下,尽量减少体外环境,如温度和灰尘等不良因素的影响。,二、MOET技术,非

10、手术采集胚胎,二、MOET技术,胚胎的收集,二、MOET技术,5、胚胎检测 在显微镜根据胚胎的形态,将胚胎分为四级： A级:胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液胞; B级:轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见到少量附着的细胞和液胞,变性细胞约占10%30%; C级:轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多,变性细胞约占30%50%; D级:轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液胞很多,变性细胞约占50%80%。,二、MOET技术,八细胞,二细胞,四细胞,十六细胞,二、MOET技术,桑椹胚,囊胚,致密桑椹胚,二、MOET技术,

11、正在孵化的胚胎,有空泡的退化胚胎,二、MOET技术,6、胚胎移植 受体牛在发情后68天之间均可进行移植。移植前对受体进行直肠触摸,检查黄体是否合格。合格受体实行12尾椎间硬膜外麻醉,擦拭外阴部。对照胚龄和受体牛发情阶段,选择适宜的胚胎,将胚胎(冻胚解冻后)装入0.25ml麦管,麦管装入移植枪,将胚胎移植到有黄体一侧子宫角小弯处。,二、MOET技术,羊手术移植,牛非手术移植,三、 IVP技术 In Vitro Embryo Production 胚胎体外生产技术,主要技术环节包括：OPU-IVM-IVF-IVC-ET 卵母细胞获取：屠宰场或活体采卵（OVUM PICK-UP,OPU） 卵母细胞体

12、外成熟（IN VITRO MATURITION ,IVM） 精子体外获能（IN VITRO CAPACITITION OF SPERMOTOZA） 体外受精（ IN VITRO FERTILIZATION,IVF) 体外培养（IN VITRO CULTURE）,IVP技术,是指雌雄配子在体外认为操作条件下完成成熟、获能和受精并发育成可移植胚胎的过程。是动物胚胎工程的一项重要技术。人们通过长期研究，已深刻了解到子宫和输卵管的环境，可以模拟该环境建立体外受精条件，从而使卵子和精子在体外能完成受精。这项技术不仅对揭示卵母细胞成熟和受精机理具有重要的理论意义，而且对畜牧业的发展具有广泛的应用前景。,三

13、、体外受精技术,历史研究： 哺乳动物体外受精研究已有一百多年历史，自1959张明觉首先把体外受精的兔受精卵移植给受体母兔获得世界上第一个“试管哺乳动物”以来，体外受精技术逐步完善，已相继在30余种哺乳动物上获得成功。,三、体外受精技术,体外受精技术包括四个主要步骤及路线： 卵母细胞体外成熟（IVM) 精子体外获能（capacitation） 体外受精（IVF) 早期胚胎发育（IVC）,三、体外受精技术,体外受精主要技术路线,三、体外受精技术,1、精子体外获能（capacitation） 定义：哺乳动物的精子在刚射入雌性生殖道时,或从附睾取出时,并不具备受精能力,必需在雌性生殖道内经过一段时间,

14、发生生理及形态学的变化才能获得受精能力,这一现象是被美籍华人科学家张明觉和澳大利亚科学家Austin发现的,后来被Austin称为精子获能(Sperm capacitation),三、体外受精技术,精子获能机制： 有能力到达卵母细胞并穿过透明带; 有能力进行获能和顶体反应; 成熟过程中获得的蛋白结合位点，能适时暴露给卵母细胞以结合透明带; 可以与卵母细胞膜融合并且将遗传物质注入到卵子的细胞质中。精子通过附睾时已经获得上述大部分能力。,三、体外受精技术,精子体外获能一般分为两步： 一是精子的洗涤： 经一次或多次离心后除去杂质、精清、死精子、低活力的精子、冻精保护液及稀释液等; 二是精子的获能处理

15、： 主要是使用高离子强度液，钙离子载体，肝素和BSA等，以促使Ca2+进入精子顶体并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。,三、体外受精技术,2、卵母细胞体外成熟（IVM) 卵母细胞体外成熟是哺乳动物体外受精技术的关键步骤之一,它直接关系到体外受精技术的成功与否。 卵母细胞在体外条件下，可自发地完成核成熟，并且可以明显地观察和记录。为了提高卵母细胞在体外成熟的效率，研究者们研究了许多与卵母细胞体外成熟相关的因素：,三、体外受精技术,2.1卵母细胞类型 一般以卵母细胞周围卵丘细胞形态对卵母细胞进行分类： A 类: 由致密多层卵丘细胞层包裹的卵母细胞; B 类:卵丘细胞层不完全的卵母细胞; C

16、类: 完全裸露的卵子; D 类: 卵丘细胞层呈蜘蛛网状附着的卵母细胞。 其中A、B类卵母细胞胞浆均匀并充满于透明带内，在IVM中一般选用这两类卵母细胞作为体外培养的对象。,三、体外受精技术,卵母细胞类型,Required Factors For Oocyte Growth In Vitro,Culture System Mammalian Oocyte,三、体外受精技术,2.2基础培养基 目前，在卵母细胞的基础培养体系中的最为广泛的是TCM199，其缓冲体系以Hepes或碳酸氢盐 (Earles salts)为好，磷酸盐缓冲系(Hanks)较差。应用TCM199对牛、猪、绵羊、山羊的卵母细胞进行体外培养依据实验设计及条件等多方面的影响，均有60%90%的成熟率。,三、体外受精技术,2.3基础培养体系的添加物 现在研究者一般都通过向成熟培养液中添加一种或几种适当的成分，如激素、血清、卵泡液、生长因子及颗粒细胞等，以模拟卵母细胞体内成熟时的环境及各种成分间的相互作