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1、药学论文-一枝蒿总黄酮的大孔吸附树脂吸附分离技术制备研究作者：热娜卡斯木，盛萍，杨小崔【摘要】 目的研究大孔树脂吸附法富集一枝蒿总黄酮的工艺条件及参数。方法以总黄酮为考察指标，用比色法测定含量，考察大孔吸附树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺条件。结果一枝蒿提取液（0.04 g 生药 /ml ）10 ml 上大孔树脂柱（R 15 mmH 290 mm），吸附 30 min 后，先用 150 ml 蒸馏水洗脱，然后，采用 150 ml 70% 乙醇洗脱，洗脱速度为 3 ml/min，洗脱剂用量为 10 倍量树脂，树脂可重复使用 3 次，采用此条件为最佳工艺。结论 HPD-450 型大孔树脂在所确定的工艺条
2、件下，可较好地吸附分离一枝蒿总黄酮。其洗脱物中总黄酮含量达 3.18% 以上，总黄酮回收率为 86.91% 以上。 【关键词】 一枝蒿；总黄酮；大孔吸附树脂Abstract：ObjectiveTo study the optimal conditions and the technological parameters for enrichment process of total flavone of Artemisia rupestris L. with macroporous absorption resin. MethodsWith the enrichment degree of t
3、otal flavone of Artemisia rupestris s L.as a marker, the optimal conditions and technological parameters of the enrichment process were investigated. ResultsThe optimum process was as follows: the concentration of extract of water from the Artemisia rupestris L. was 0.04 g/ ml; eluting velocity, 3 m
4、l/ min; the eluting reagent, 70% ethanol (10 times the volume of the resin); and the HPD-450 resin could be used 3 times repeatedly. ConclusionThe results showed that HPD-450 macroporous resin could well absorb and separate Artemisia rupestris L. total flavone under the set technological conditions,
5、 and the content of total flavone in Artemisia rupestris L. is over 3.18%, with a total flavone recovery rate of over 86.91%.Key words：Artemisia rupestris L.; Total flavone; Macroporous absorption resin 新疆一枝蒿 Artemisia rupestris L为菊科 Compositae 蒿属 Artemisia L苦艾组植物，以全草入药，仅分布在新疆。具有清热解毒、消食健胃、散瘀消肿、抗过敏、解
6、蛇毒、利胆等功能，用于感冒发烧、消化不良、腹胃胀痛、荨麻疹、蛇虫咬伤、肝炎等症16。其主要成分为黄酮类、倍半萜类、有机酸类化合物78，其中黄酮类化合物为其主要活性成分。本文采用大孔树脂吸附技术，以一枝蒿主要活性成分总黄酮为评价指标，对 9 种树脂进行了筛选并着重考察了 HPD-450 型大孔吸附树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺条件与参数。现报道如下。1 材料与仪器1.1 药材及试剂芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号 100080-200306)，新疆一枝蒿 Artemisia rupestris L实验药材由新疆维吾尔自治区人民医院药剂科提供并给予品种确认；AB-8 型大孔吸附树脂(天津市光复
7、精细化工研究所)，HPD-100，HPD-300，HPD-400，HPD-450，HPD-500 树脂（河北沧州宝恩化工有限公司），HP-20 树脂、HP2MGL 树脂、SP-825 树脂（日本三菱公司）。所用试剂均为分析纯。1.2 仪器Spectrumlab 54 紫外分光光度计(上海市棱光有限公司)； KQ-400DB 型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)； 电子天平(Sartorius 德国产)；DZF-6021 型真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)； DRT-SX 型恒温电热套（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52 旋转式蒸发器(上海安亭电子仪器厂)。2 方法与结果2.1 一
8、枝蒿总黄酮的含量测定2.1.1 比色原理和最大吸收波长的选择一枝蒿中含有多种黄酮类化合物，其黄酮母核所含的游离羟基，在适当的介质条件下能与金属铝离子形成络合物而显色。显色后对照品和供试品溶液有相似的吸收光谱，见图 1。由图 1 可知，二者在 498 nm 处均有最大吸收，故测定波长选择 498 nm。2.1.2 对照品溶液的制备精密称取在 120 减压干燥至恒重的芦丁对照品 10 mg，置 50 ml 容量瓶中，加甲醇少许，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即得，备用。精密量取芦丁对照品溶液 0，1，2，3，4，5，6 ml，分别置 25 ml 容量瓶中，各加水至 6 ml，加 5
9、% 亚硝酸钠溶液 1 ml 使混匀，放置 6 min，加 10% 硝酸铝溶液 1 ml，混匀，放置 6 min，加氢氧化钠溶液 10 ml，再加水至刻度，混匀，放置 15 min，照分光光度法在 498 nm 波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为 A = 11.019 C + 0.0017，r = 0.9998。2.1.3 供试品溶液制备和总黄酮含量测定一枝蒿药材 20 g，加 14 倍量蒸馏水回流提取 3 次，30 min/次，过滤，合并滤液，浓缩，定容至 500 ml（0.04 g 生药 / ml）作为样品液。从中吸取0.8 ml 照
10、标准曲线项下方法“加水至 6 ml”依法测定吸光度，测得一枝蒿总黄酮含量为 3.74% ， RSD=1.25% (n=5)。2.2 树脂的筛选2.2.1 大孔吸附树脂的预处理以乙醇湿法装柱,用 95% 乙醇在柱上流动清洗，不时检出流出液至乙醇液与水混合(15)不成白色混浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇至无醇味。2.2.2 树脂的筛选精密吸取 5 ml 一枝蒿样品液分别通过 9 种不同型号的已预处理好的树脂柱，静置 30 min，依次用蒸馏水、70% 乙醇洗脱，收集 70% 乙醇洗脱液，蒸干，用蒸馏水定容于 10 ml 容量瓶中，从中精密吸取 2.5 ml，照标准曲线项下方法“加水至 6 ml”
11、依法测定吸光度，测定一枝蒿总黄酮含量，并计算总黄酮回收率，结果见表 1。表 1 不同型号树脂对总黄酮含量的影响（略）由表 1 可见，在筛选的 9 种树脂中，用 HPD-450 树脂纯化分离一枝蒿总黄酮，总黄酮量和总黄酮回收率均最高，故确定 HPD-450 树脂为分离纯化一枝蒿总黄酮的最佳树脂。2.3 考察 HPD-450 树脂富集一枝蒿总黄酮的工艺参数2.3.1 洗脱剂的考察精密吸取 5 ml 一枝蒿样品液分别通过 4 根 HPD-450 树脂柱，4 根树脂柱分别用水洗脱至洗脱液近无色，再分别用 30% ，50% ，70% ，90% 乙醇洗脱，分别回收洗脱液，蒸干， 用蒸馏水定容于 10 ml
12、 容量瓶中，从中精密吸取 2.5 ml，照标准曲线项下方法“加水至 6 ml”依法测定吸光度，测定一枝蒿总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表 2。表 2 不同浓度洗脱剂对一枝蒿总黄酮的影响（略）表 2 结果显示，70% 乙醇洗脱液中总黄酮含量和回收率均最高，故确定 70% 乙醇液为最佳洗脱剂。2.3.2 最佳上柱量的考察分别吸取一枝蒿样品液 4，5，10，15 ml 上柱且静置 30 min，依次用蒸馏水 150 ml，70% 乙醇 150 ml 洗脱，测定总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表 3。表 3 不同上柱量对一枝蒿总黄酮的影响（略）由表 3 可见，上柱量为 10 ml 时，洗脱液
13、的总黄酮含量及总黄酮回收率均最高，说明 10 ml 上柱量是 HPD-450 的饱和上柱量。故选择 10 ml 为最佳上柱量。2.3.3 洗脱速度的考察分别吸取一枝蒿样品液 10 ml 上 4 根树脂柱，以蒸馏水和 70% 乙醇洗脱，分别以 1，2，3，4 ml / min 的速度洗脱，测定其总黄酮含量，并计算总黄酮回收率。结果见表 4。表 4 不同洗脱流速对一枝蒿总黄酮含量影响的考察结果（略）由表 4 可见，洗脱流速为 3 ml/ min 时，总黄酮含量与回收率均最大，故确定最佳洗脱流速为 3 ml/min 。2.3.4 最佳吸附时间的考察分别吸取 10 ml 样品液 4 份，通过 4 根树
14、脂柱，分别静置 5，15，30，60 min，依次用蒸馏水，70% 乙醇洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算总黄酮回收率。结果见表 5。表 5 不同吸附时间对一枝蒿总黄酮的影响（略）由表 5 可见，吸附时间为 30 min 时总黄酮含量与其回收率均最高。故确定最佳吸附时间为 30 min。2.3.5 洗脱曲线的考察按上述确定的吸附洗脱条件，吸取 10 ml 一枝蒿样品液进行过柱，分段收集洗脱液，每个树脂体积（湿体积）收集 1 份，共收集15 份，分别测定吸光度，并计算总黄酮含量。结果见表 6。表 6 不同流份中总黄酮含量的比较（略）由表 6 可知，第 11 份洗脱液中总黄酮含量已经很少，可认
15、为树脂柱上吸附的总黄酮已经洗脱完全，故确定洗脱剂用量为 10 倍量树脂体积。2.3.6 树脂重复使用次数考察按上述确定的吸附洗脱条件，取一枝蒿样品液进行过柱，在同一根树脂柱上重复操作 7 次，分别计算 7 次的总黄酮含量与其回收率。结果见表 7。表 7 树脂重复过柱对总黄酮含量的影响（略）由表 7 可知，树脂重复使用 3 次后，一枝蒿总黄酮含量及回收率均已明显下降，需要再生才可继续使用，故确定树脂可重复使用 3 次。3 讨论用大孔树脂吸附，70% 乙醇洗脱一枝蒿总黄酮，并采取比色法测定总黄酮含量。实验结果证明 HPD-450 型大孔吸附树脂对一枝蒿总黄酮有良好的分离富集性能。其最佳工艺条件为：
16、一枝蒿提取液上样浓度为 0.04 g 生药/ ml，上样量为 10 ml，洗脱溶剂为 70% 乙醇，洗脱剂用量为 10 倍量树脂体积，吸附时间为 30 min，洗脱速度为 3 ml/ min，树脂可重复使用 3 次。在此条件下，洗脱物中一枝蒿总黄酮含量达 3.18% 以上，总黄酮回收率达 86.91% 以上。样品经过大孔吸附树脂吸附，70%乙醇洗脱后，对洗脱液蒸干后的溶解性能进行了考察。结果表明，蒸馏水对本样品的总黄酮有更好的溶解性，故在所有条件的考察中，洗脱液蒸干后均用蒸馏水做溶解定容试剂。大孔吸附树脂是一种人工合成的多聚物吸附剂，其吸附能力是由树脂孔径、比表面积、表面电性或形成氢键等因素共同决定的。这些因素又成为大孔树脂吸附能力大小的影响因素。尽管大孔吸附树脂自身也存在一些问题，如：溶剂和致孔剂残留、吸附效果易受流速和上样浓度等的影响等,但大孔吸附树脂比其它天然吸附剂具有不可代替的优点：其不但孔径大小、比表面积、极性等可以任意选择；而且具有吸附
