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1、医学论文-两种小鼠胚胎移植方法的比较作者：赵四海，郑华东 1，楚雍烈，林燕，张春芳，陈正兰，朱虹，杨鹏辉，刘恩岐 【关键词】 胚胎移植；囊膜；小鼠；成功率Comparison of two embryo transfer methods in mice【Abstract】AIM: To promote the success rate of embryo transfer in mice by improving the traditional embryo transfer method. METHODS: Embryos were transferred to oviducts of 10
2、6 recipients by the traditional method (tearing the bursa open over the infundibulum of oviduct) or the improved method (puncturing a hole in bursa with embryo transfer pipette and blowing embrys into oviduct through the hole). ICR (n=31) and C57BL/6 (n=16) pseudopregnant mice were transferred embry
3、os by the improved method and other ICR (n=39) and C57BL/6 (n=20) mice did by the traditional method. RESULTS: The improved method reduced the blooding of bursa and the followed inflammatory adherence between oviduct and body wall, so it could achieve a relatively higher success rate of embryo trans
4、fer. CONCLUSION: The improved embryo transfer method can raise the success rate of embryo transfer in mice.【Keywords】 embryo transfer; bursa; mice; success rate【摘要】目的： 通过将传统的撕破囊膜进行小鼠胚胎移植的方法改为囊膜穿刺，以期提高胚胎移植的成功率. 方法： 共移植 ICR 和 C57BL/6 供体小鼠106 只，其中改进方法移植 47 只（ICR 小鼠 31 只，C57BL/6 小鼠 16 只），传统方法移植 59 只（ICR
5、 小鼠 39 只，C57BL/6 小鼠 20 只）. 结果： 囊膜穿刺方法将输卵管和腹壁的炎性黏连发生率由 60%降低到了 20%，减轻了对移植后胚胎存活的不利影响，将 ICR 小鼠和 C57BL/6 小鼠胚胎移植成功率分别提高到了 61%和37%. 结论： 通过囊膜穿刺进行胚胎移植提高了胚胎移植成功率. 【关键词】 胚胎移植；囊膜；小鼠；成功率0 引言1980 年，Gordon 等1首次利用显微注射方法制作成功转基因小鼠. 此后，转基因小鼠逐渐成为生物医学研究中重要的实验动物模型2-3. 胚胎移植技术是制作转基因动物的关键技术之一，提高胚胎移植成功率的研究对提高转基因动物的制作效率具有重要意
6、义. C57BL /6 小鼠是国际通用的标准近交系小鼠，ICR 小鼠也是国内进行转基因研究的常用品系. 我们选用这两种品系小鼠对改进的经囊膜穿刺胚胎移植术和传统的撕破囊膜移植术进行了比较研究. 1 材料和方法1.1 材料 ICR 和 C57BL/6 小鼠（西安交通大学实验动物中心）. 所有实验用小鼠均在 SPF 动物房饲养，温度控制在(223)，光控(12 h 明/12 h 暗)，自由采食. Co60 灭菌饲料（第四军医大学实验动物中心）；孕马血清(PMS，宁波激素厂）；绒毛膜促性腺激素 (hCG，宁波激素厂）；透明质酸酶（美国Sigma 公司）；M2 和 M16 培养液均为自制；CO2 培养
7、箱（美国 Shel lab 公司）；体视显微镜（日本 Nikon 公司）；显微手术器械.1.2 方法1.2.1 胚胎移植术前准备41.2.1.1 超数排卵和同期发情用 PMS 和 hCG 诱发供体雌鼠同期发情和超数排卵. 在实验第 1 日腹腔注射 PMS(0.5 U/只)，4648 h 后给供体鼠注射hCG（0.5 U/只），hCG 注射当日（实验第 3 日）下午和雄鼠合笼，次日6:308:00 检查雌鼠有无阴栓以判定是否已经交配. 1.2.1.2 受体鼠的准备实验开始前提前准备输精管结扎雄鼠，挑选至少两次和雌鼠交配后都不能使其受孕的结扎雄鼠备用. 实验第 3 日下午合笼受体鼠和结扎雄鼠，次日
8、 06:3008:00 检查雌鼠有无阴栓以判断是否已经交配，交配成功的雌鼠作为胚胎移植的受体鼠. 1.2.1.3 受精卵的收集处死供体鼠，打开腹腔，取出输卵管（保留一小段子宫）. 将输卵管置于 M2 培养液中，用小镊子撕开输卵管膨大部，可见有卵团溢出，用吸管5-6将卵团转移至含有透明质酸酶的 M2 培养液滴中，吹吸数次，洗掉卵细胞周围的泡沫细胞. 将受精卵转移至含有 M16 培养液滴的培养皿中，37, 50 mL/L CO2 培养箱内短暂培养. 1.2.2 胚胎移植方法将 106 只受体雌鼠随机分为两组，其中一组（59 只）采用传统的胚胎移植方法4；另一组（47 只）采用改进的胚胎移植方法，手
9、术方式如图 1 所示.图 1 胚胎移植不同术式比较略1.2.2.1 传统的胚胎移植方法4用水合氯醛麻醉受体鼠，沿受体鼠背部中线最后一根肋骨水平切 1 cm 左右切口，轻轻拨开切口，可见位于卵巢上方的白色脂肪垫. 用小镊子夹住白色脂肪垫将其拉到体外，用小血管夹夹住，并靠其重力起固定作用，以防输卵管缩回体腔. 用移卵管吸 1520 个受精卵准备移植. 将小鼠转到解剖镜下仔细寻找到输卵管. 可见输卵管被一层呈半透明的囊膜所包绕，将囊膜撕破而暴露输卵管，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部（图 1 A）.1.2.2.2 改进的胚胎移植方法麻醉及手术区域暴露同上，但在胚胎移植囊膜处理时不同. 先用吸卵管在
10、囊膜无或少血管分布处穿一小洞（也可先用大头针针头穿），再将吸卵管通过囊膜上的小洞轻轻送进输卵管口，将移卵管内受精卵移植到输卵管膨大部（图 1 B）.统计学处理： 数据采用 SPSS11.5 统计软件进行分析，根据资料类型分别采用 t 检验和 2 检验，以 P0.05 为差别有统计学意义（双侧）.2 结果 2.1 胚胎移植术改进前后 ICR 小鼠胚胎移植成功率比较 ICR 小鼠在改进胚胎移植术式后比传统的胚胎移植技术在成功率上有较大的提高，统计学比较有显着差异（P0.01，表 1）.表 1ICR 小鼠和 C57BL/6 小鼠不同术式后胚胎移植成功率比较（略）2.2 胚胎移植术改进前后 C57BL
11、/6 鼠胚胎移植成功率比较 C57BL/6 小鼠的改进胚胎移植术式比传统胚胎移植技术的成功率有较大提高（表 1），但统计学差异不显着. 2.3 不同术式后未怀孕受体鼠手术部位和腹壁黏连发生率比较对部分未怀孕的受体鼠进行解剖发现，传统术式容易引起手术部位的黏连，而改进胚胎移植方法后，黏连的发生率显着降低（P0.05，表 2）. 表 2 不同术式后未怀孕受体鼠手术部位和腹壁黏连发生率比较（略）2.4 品系对胚胎移植成功率的影响改进胚胎移植术式后 ICR 小鼠胚胎移植成功率高于 C57BL/6 小鼠（表 1）.3 讨论胚胎移植是转基因动物制作过程中的重要技术之一，影响胚胎移植成功的因素有很多7. 要
12、提高胚胎移植成功率除了加强专门技术训练，还可以对原有技术进行改进. 囊膜是从卵巢垂下包裹着输卵管的一层较为透明的膜状结构，在输卵管收集卵巢排出的卵子方面可能具有辅助作用. 囊膜毛细血管的分布较为丰富，传统的胚胎移植术在撕破囊膜时完全避开血管是比较困难的. 囊膜是透明的，可以用吸卵管或细的大头针针头在无血管分布处穿一个小口，让移卵管通过这个小口进入输卵管伞部移植受精卵. 这样降低了对囊膜的机械损伤，可以减少出血，降低输卵管部位术后跟腹壁的炎性黏连，而减少手术出血及术后继发的炎症黏连是手术成功的重要保证. 因此，我们在胚胎移植时采用改进的经囊膜穿刺胚胎移植术避免了传统手术方式的撕破囊膜，达到了降低
13、术中出血的可能性和术后炎症引起的输卵管手术部位和腹壁的黏连. 最终实验结果也表明，改进的经囊膜穿刺胚胎移植术提高了胚胎移植成功率. 小鼠品系也是影响胚胎移植成功率的重要因素之一7-8. 实验中我们也发现 ICR 小鼠胚胎移植成功率要优于 C57BL/6 小鼠，但是产仔数量并不比C57BL/6 多. 改进胚胎移植术后，C57BL/6 小鼠的胚胎移植成功率也有所升高，但统计学差异不显着，可能与我们统计样本较少有关. 【参考文献】1 Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, et al. Genetic transformation of mouse embryos by
14、 microinjection of purified DNA J. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77（12）：7380-7384.2 刘恩岐，尹海林，薛智谋，等. 医学实验动物学M. 北京：人民卫生出版社，2004：10-14.3 赵四海，郑华东，刘恩岐. 生物医学研究中实验动物的应用状况与分析J. 中国比较医学杂志, 2006,16（4）：245-248. 4 Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual M. 3
15、th. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003:263-300.5 刘恩岐, 杨鹏辉, 林，等. 小鼠胚胎吸管的改进 J. 西安交通大学学报(医学版)，2002，23(6)：609-610.6 Liu E, Kitajima S, Morimoto M. Create transgenic rabbits by microinjection human apoAII gene into fertilized eggs J. Acad J XJTU，2004，15（1）： 67-70.7 吴红，朱孝荣，孙强，等. 影响小鼠 1 细胞期胚胎移植成功率有关因素的探讨 J. 实验动物科学与管理，2002，19（1）：49-51.8 张庆玲, 贺莉, 杨玉芳, 等. 小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究J. 第四军医大学学报, 2006，27（14）：1249-1252.
