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1、药学论文-一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释作者：潘渠 胡袁 邓林 雷舜 胡晓梅 胡福泉【摘要】 在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CICC 6002）中发现了 1个隐蔽质粒（pLP2111），并将其克隆到 pUC 18 质粒上进行测序。序列分析表明 pLP2111 大小为 2 111 bp； 仅有 1 个 ORF，编码 1 个 37.0 kDa 的复制蛋白；有 1 个 17 bp 的重复序列重复了 13 次。BLAST 结果显示 pLp 2111 和植物乳杆菌 CCM 1904 菌株的 pLP1 质粒相似性最高，为 99 %，pLP2111 比 pLP1 大 18
2、 bp.pLP2111 可能构建为良好的乳杆菌或乳球菌异源蛋白表达载体。 【关键词】 植物乳杆菌； 隐蔽质粒； 测序； 注释【Abstract】 The complete nucleotide sequence of a cryptic plasmid isolated from Lactobacillus plantarum strain CICC 6002 has been determined.The plasmid,designated pLP2111,has 2,111 bp,encodes a 37.0 kDa Rep protein and has a 17 bp sequenc
3、e repeated 13 times.The result of BLAST showed that pLP2111 is 99 % identical to pLP1 (2,093 bp) of Lactobacillus plantarum strain CCM 1904.The pLP2111 may be constructed as a good heteroexpression vector.【Key words】 Lactobacillus plantarum； cryptic plasmid； sequence; analysis植物乳杆菌作为乳杆菌的一员，具有增强机体免疫力
4、、降低机体胆固醇水平、帮助消化和维持肠道微生态平衡的生理功能，对人体健康有益； 而且该菌已被广泛用于青贮饲料、肉类和蔬菜的乳酸发酵中。目前，其基因工程改造是研究热点，例如将其改造为可口服的疫苗投送载体和酶投送载体。但是，由于乳杆菌转化效率远低于大肠杆菌，导致其转化成功率低、重复性差，成为基因工程改造的难关。寻找新的质粒，从而构建转化率高的表达载体是促进乳杆菌基因工程发展的方法之一。自从 1976 年 Chassy1首次在乳杆菌中发现质粒以来，已经有上百个乳杆菌质粒被发现，大小从几千个碱基对到几十万个碱基对都有，其中多数为隐蔽性质粒，少数质粒与某些表型，如抗药性、糖苷代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细
5、菌素产生与免疫等密切相关。在 Genbank 数据库中，登录有 13 个植物乳杆菌质粒的完整序列（见表 1）。发现新的质粒对植物乳杆菌分子生物学的研究有重要的意义，尤其在构建新的植物乳杆菌表达载体上。本研究从植物乳酸杆菌 CICC 6002 菌株中分离了一个隐蔽性质粒，并进行了测序和注释工作，该质粒有可能构建为良好的表达载体。1 材料和方法1.1 菌株和质粒植物乳杆菌 CICC 6002 菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心。培养条件为：在 37 下，于 MRS 培养液11中静置培养 24 h.大肠杆菌 DH5 菌株由本实验室保存，培养条件为：在 37 下，于 LB 培养液培养过夜。质粒 PUC
6、 18为本实验室保存。表 1 在植物乳酸杆菌中发现的质粒列表1.2 质粒提取离心收集植物乳杆菌 CICC 6002 的菌体，用华舜质粒提取试剂盒（华舜，上海）提取质粒。不同于说明书的步骤是：用 GTEL 溶液（葡萄糖 50 mmol/L ，TrisCl 25 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，溶菌酶 10 mg/mL，pH 8.0）代替solution I 重新悬浮菌体，并在 37 温育 15 min，以破坏该菌细胞壁的肽聚糖层。使用华舜胶回收试剂盒分离纯化各质粒条带。1.3 构建测序载体经预试验确定植物乳杆菌的该质粒具有一个 EcoR酶切位点。对该质粒和载体质粒 PUC 18 使用
7、 EcoR（farmentas,MBI）分别进行酶切，并将酶切产物用 T4DNA 连接酶连接。连接产物电转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，电转化产物涂布于含青霉素、IPTG 和 XGal 的 LB 平板上，培养 18 h 后挑取白色菌落培养并提取质粒。经酶切鉴定后，送上海生物工程公司测序。1.4 序列注释 利用 BLAST 序列比对工具对 Genbank 数据库中所有核酸序列比对，检索该质粒和已知乳杆菌质粒的同源性。利用 DNAStar 软件标注该质粒可能存在的开放阅读框（ORF）。利用 DNAclub 软件标注该质粒的重要酶切位点。2 结果2.1 质粒提取电泳结果显示植物乳杆菌 CICC 6
8、002 的质粒提取液有 2 条带（图 1），分别为 5 kb 和 1.3 kb.EcoR酶切试验表明 5 kb 条带不能被 EcoR切开，而1.3 kb 条带被切开为线状，从 1.3 kb 变为 2.1 kb（图 2）,说明这两个条带是不同的质粒。将 1.3 kb 条带代表的质粒命名为 pLP2111.2.2 测序构建的重组质粒 PUC 18pLP2111 在 EcoR酶切后，电泳显示有 2.7 kb和 2.1 kb 两条带（图 3），证明测序载体构建成功。测序结果提交 Genbank，登录号为：FJ 375766.2.3 注释质粒 pLP 2111 的 GC 含量为 38.3 %,BLAST
9、 比对结果显示：该质粒与质粒pLP1（GenBank number ：M 31223.1）有 99 %的相似性。不同之处是质粒 pLP 2111 在 14431459 bp 和 2051 bp 处分别多出 17 bp 和 1 bp 的碱基序列（图4）。通过 ORF 搜索，发现该质粒仅有 1 个编码框，从 262 到 1215 共 954 bp，编码 1 个 318 个氨基酸残基的复制蛋白。乳杆菌、葡萄球菌和链球菌等革兰阳性菌的许多质粒中都存在该复制蛋白。该复制蛋白属于第一复制蛋白超家族，功能为起始质粒的滚环复制。该质粒没有编码影响菌株表型的蛋白，应归为隐蔽质粒。通过重复序列检索发现该质粒有 1
10、3 个重复序列，从 1335 到 1571 之间，有 1 个 17 bp 的序列“cattatcatgtagtgcg”正向重复了 13 次，该重复序列可能和质粒的拷贝数有关。该质粒的复制起点在 20682081 之间,主要的酶切位点如图 5 所示。 3 讨论质粒是一种资源,发现新的质粒，对于微生物的遗传研究和构建具有自主知识产权的表达载体都具有重要意义。植物乳杆菌又是公认安全的微生物，可直接口服，是食品级的微生物，是良好的生物工程菌出发菌株,但由于目前所用的载体转化效率均不高，以致于难以在植物乳杆菌中进行基因工程的操作。寻找新的质粒，并从中找到转化效率高的质粒，一直是提高乳杆菌转化效率的方法之
11、一。本文发现的植物乳杆菌质粒 pL2111 可以作为构建高效率表达载体的候选质粒，对乳杆菌基因工程研究有重要意义。【参考文献】1 Chassy BM,Gibson E,Giuffrida A.Evidence for Extrachromosomal Elements in LactobacillusJ.J Bacteriol，1976,127(3):1 5761 578.2 Bouia A,Bringel F,Frey L,et al.Structural Organization of pLP1,a Cryptic Plasmid from Lactobacillus Plantarum
12、CCM 1904J.Plasmid，1989,22(3):185192.3 Vujcic M,Topisirovic L.Molecular Analysis of the Rollingcircle Replicating Plasmid pA1 of Lactobacillus Plantarum A112J.Appl Environ Microbiol，1993,59(1):274280.4 van KR,Golic N,Bongers R,et al.Functional Analysis of Three Plasmids from Lactobacillus PlantarumJ.
13、Appl Environ Microbiol，2005,71(3):1 2231 230.5 Daming R,Yinyu W,Zilai W.Complete DNA Sequence and Analysis of Two Cryptic Plasmids Isolated from Lactobacillus PlantarumJ.Plasmid,2003,50(1):7073.6 Danielsen M.Characterization of the Tetracycline Resistance Plasmid pMD5057 from Lactobacillus Plantarum
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