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1、第二章 蛋白质的分离纯化,第一节 能用作纯化依据的蛋白质性质 第二节 蛋白质分离纯化的一般步骤 第三节 蛋白质的分离纯化方法,分离纯化蛋白质的目的: 将蛋白质和非蛋白质杂质分离 将不同的蛋白质相互分离。 分离提纯蛋白质的要求： （1）纯度 （2）活性 （3）得率 （4）速度,第一节 能用作纯化依据的蛋白质性质,第二节 蛋白质分离纯化的一般步骤,（一）前处理 （二）粗分级 （三）细分级,动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织； 种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动
2、捣碎机 或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。,（一）前处理,1、选材 2、破碎 3、混合物的分离,（二）粗分级分离,（1）盐析 （2）等电点沉淀 （3）有机溶剂分级分离 （4）超滤 （5）凝胶过滤 （6)冷冻干燥,（三）细分级分离,结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。,一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时
3、还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。,第三节 蛋白质的分离纯化方法, 一、根据分子大小不同的纯化方法 二、利用溶解度差别的纯化方法 三、根据电荷不同的纯化方法 四、利用选择性吸附的纯化方法 五、利用配体的特异性亲和力的纯化方法,一、根据分子大小不同的纯化方法, 1.透析和超滤 2.密度梯度离心 3.凝胶层析,1.透析和超滤,透析只用于除盐类和小分子杂质,透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐
4、玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料,超滤（ultrafiltration） 除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质,2.密度梯度离心法（density gradient）,生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。,滴加样品,离心管,蔗糖密度梯度,蔗糖浓度,密度梯度离心,以Au 纳米颗粒的分离的效果,胶体颗粒
5、通过密度梯度超离心示意图,3.凝胶层析,又叫分子筛层析。 分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）,凝胶层析原理示意图,分子筛层析与洗脱曲线,凝胶颗粒,收集蛋白质管,蛋白质混合物,大分子,从柱上面加缓冲溶液,小分子,洗脱体积
6、（Ve）,凝胶柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,蛋白质Mr=49,000,洗出液中的蛋白质浓度,洗脱体积（mL）,未知,logMr,洗脱体积与相对分子质量的关系,Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo),二、利用溶解度差别的纯化方法, 1.等电沉淀和pH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离 4.温度对蛋白质溶解度的影响,1.等电沉淀和pH控制,蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分
7、子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH 5.2-5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。,2.蛋白质的盐溶和盐析,低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in), 盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子
8、彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。,3.有机溶剂分级分离,（1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀 主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 （3）有分级分离现象 （4）要求对有机溶剂低温预冷。,4.温度对蛋白质溶解度的影响,在一定温度范围内，约0-40之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25，溶解度随温度上升而降低。在4
9、0-50以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0 或更低的温度下进行。,三、根据电荷不同的纯化方法, 1.电泳概述 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.毛细管电泳 4.等电聚焦 5.层析聚焦 6.离子交换层析,1.电泳概述,电泳： 根据支撑物分： 根据电泳槽类型分： 根据蛋白质性质特点分：,据电泳槽类型分,垂直板电泳,水平板电泳,圆盘电泳,聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它
10、作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。,聚丙烯酰胺凝胶性质,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,分离胶 pH 8.8,制备浓缩胶,浓缩胶 pH6.8,分离胶 pH 8.8,上样及电泳,开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,3.毛细管电泳,毛细管电泳的原理,毛细管电泳 分离模式,1 毛
11、细管区带电泳 2 胶束电动色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 毛细管等速电泳 5 毛细管等电聚焦 6 毛细管电色谱,Waters 的CapLC-ESI-Q-Tof Micro毛细管液相-串级质谱联用仪,4.等电聚焦（isoelectric focusing）,原理: 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。 应用： 高效率分离纯化
12、蛋白质 测定蛋白质pH,pH10,pH3,pI1= pH8,pI2= pH7,pI3= pH5,-,+,线性梯度,5.聚焦层析 Chromatofocusing）,该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一
13、种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。,层析时的聚焦效应示意图,6. 离子交换层析 （ion-change chromatography）,原理 基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,离子交换层析原理示意图,NaCl梯
14、度,梯度混合器,常用的阳离子交换剂,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基,P-纤维素（中强弱酸型） 磷酸基,SE-纤维素（强弱酸型） 磺乙基,SP-纤维素（强弱酸型） 磺丙基,常用的阴离子交换剂,AE-纤维素（弱减型） 氨基乙基,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,PAB-纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸,DEAE-纤维素 二乙基氨基乙基,DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基,DEAE -纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基,QAE-纤维素（强减型）,二乙基（2-羟丙 基） -氨基乙基,（中弱减型）,（中弱减型）,四、利用选择性吸附的纯化方法, 1.羟磷
15、灰石层析 2.疏水作用层析,某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而异。吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引力。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。,1.羟磷灰石层析,吸附剂羟磷灰石即结晶磷酸钙，它用于分离蛋白质或核酸。羟磷灰石的吸附机制尚不完全清楚，但认为与其表面上的钙离子和磷酸根有关，涉及偶极-偶极相互作用，可能还有静电吸引。 据推测，蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互作用。羟磷灰石层析最重要的用途之一是把单链DNA和双链DNA分开。羟磷灰石对双链DNA亲和力很大，以致用羟磷灰石层析能从含RNA和蛋白质的细胞提取液中选择性地除去DNA羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大，在一般吸附条件下（底离子强度，中性pH）可达50g蛋白/L柱床体积。,2.疏水作用层析,疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。市售的疏水吸附剂有苯基琼脂糖、辛基
