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1、第2讲 生物大分子和中心法则1.DNA变性后对紫外线（260nm）吸收增强2.同裂酶（isoschizomer）：来源不同但识别相同靶序列的限制性内切酶 同尾酶（isocaudomer）：来源不同，产生相同的黏性末端，但识别序列不相同的限制性内切酶3.限制性内切酶不能识别特定位点甲基化的DNA，从而防止自身DNA的降解4.什么是Cot1/2：Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles second/liter.5.高重复序列的Co
2、t1/2低重复序列的Cot1/2 琼脂糖凝胶电泳的分辨率3. PFGE（pulsed-field gel electrophoresis，脉冲场凝胶电泳）用于分离大分子量的DNA；原因：当DNA分子量较大时，其分子量的对数与迁移率不成正比大分子量的DNA易断裂4.做Northern Blot的时候需要一个对照，一般用管家基因5.分子生物学实验方法：凝胶电泳：PFGE（pulsed-field gel electrophoresis，脉冲场凝胶电泳）、PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)、 Two-dimensional gel electrophoresis（双向凝胶电泳）、Agarose gel
3、 electrophoresis（琼脂糖凝胶电泳）层析：Ion-exchange chromatography（IEC, 离子交换层析）、Gel- filtration chromatography（凝胶过滤层析）affinity chromatography（亲和层析）Labeled tracers（标记示踪）：Autoradiography（放射性自显影）、Phosphorimaging（磷屏成像）、Nonradioactive tracers（非放射性示踪，即化学示踪）检测蛋白质与DNA的相互作用：EMSA （Electromobility Shift Assays，凝胶迁移滞后分析）、
4、酵母单杂交、footprinting检测两种蛋白的相互作用：酵母双杂交、Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)核酸杂交：Northern blot、Southern blotMapping transcripts、Nuclear Run-on transcription（转录活性测定)、Reporter gene transcription、Western blot、RFLP(restriction fragment length polymorphism)、DNA fingerprinting、In situ-hybridization
5、、DNA sequencing、Automated DNA sequencing、Restriction Mapping、Site-directed mutagenesis（定点突变技术)6.报告基因的作用：研究基因的亚细胞定位研究基因表达模型7. 细菌质粒命名：用小写字母p表示质粒在其后面用几个大写字母表示质粒的性质或实验室名称或构建发现此质粒的作者在大写字母后面用数字编号其他：表示缺失，表示DNA插入，表示蛋白质融合，表示融合时发生了缺失，如lacZ则表示lacZ基因的3部分发生缺失基因和蛋白质的表示方式：正常基因：大写斜体突变基因：小写斜体蛋白质：大写正体抗性基因：第一个字母大写，并加上
6、“+”或“r”表示有抗性，加上“-”则表示敏感。如：Ampliciliin（氨苄青霉素），抗性标记为Ampr 质粒：正体大写，前面加正体小写p启动子：基因前加斜体小写p第4讲 DNA复制1.DNA复制所需要的酶（或蛋白）及功能酶的种类功能酶的种类Helicase使DNA解链TopoisomeraseSSBP（Single-Strand DNA-Binding protein）阻止已分开的DNA单链重新结合、防止单链DNA降解DNA polymeraseDNA ligasePrimase2.拓扑异构酶的作用：为了DNA复制而解开DNA双链复制区的双螺旋结构，从而导致其它区域产生拓扑结构和超螺旋，
7、这会阻止DNA的进一步解旋和复制。拓扑异构酶的作用就是消除由此产生的超螺旋，促进DNA复制。第一类拓扑异构酶也称为缺口闭合酶，引起DNA单链的暂时性断裂，参于DNA超螺旋结构的解除。该类酶促反应所需能量来自拓扑应力的释放。第二类拓扑异构酶也称为DNA旋转酶，引起DNA双链的暂时性断裂，既能解除超螺旋结构，也能产生超螺旋结构DNA。其酶促反应需要ATP提供能量。3.原核生物中的DNA聚合酶特点聚合酶聚合酶聚合酶5核酸外切酶（移除RNA引物）3核酸外切酶（校正功能）生物功能切除RNA引物并填补由此引起的DNA缺口；DNA修复SOS DNA修复DNA复制链的延长应用催化DNA缺口平移反应，制备DNA
8、探针第二条cDNA链的合成对DNA 3凸出末端进行末端标记DNA序列分析4.真核生物中的DNA聚合酶种类定位功能聚合酶细胞核引发两条DNA链的复制聚合酶细胞核DNA修复聚合酶线粒体线粒体DNA复制聚合酶细胞核DNA双链的复制聚合酶细胞核DNA修复5.端粒酶的作用原理：端粒酶利用自身携带的RNA模板添加一段末端重复序列到前导链的3 端。根据该段序列合成RNA引物，并利用引物合成后随链5 末端的DNA。最后，RNA引物与前导链3端的重复序列一起被降解。6.原核生物中DNA复制总结：在第一类拓扑异构酶与解链酶作用下，复制叉沿复制方向移动。单链结合蛋白结合在单链上保证单链不复性。前导链与滞后链均由DN
9、A聚合酶III合成。前导链合成以35链为模板（按53合成），以引物酶合成的RNA引物为引物。滞后链环绕在聚合酶III上使其合成方向也按53方向进行。同时也使其的合成与前导链合成协同。引物合成体在滞后链分叉的方向上前进，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的引物RNA，再由DNA聚合酶III作用合成DNA(Okazaki片段)，直至遇到下一个Okazaki片段，DNA聚合酶降解RNA引物并由DNA聚合酶I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个Okazaki片段连接形成大片段DNA。第5讲 原核细胞中的转录1.原核基因的结构： 图中的“识别位点”是指转录因子与DNA的识别位点，从而引发RNA聚合酶与D
10、NA的结合启动子核心元件：10区、35区；启动子与UP元件的距离越近，其启动效果越强。转录起始位点的特点：绝大多数是嘌呤；G的频率A的频率；两侧绝大多数是C和T，如CAT，CAC2.RNA聚合酶核心酶+亚基；核心酶2个亚基+亚基+亚基3.核心酶的特性：只能转录断裂的DNA；缺少亚基的RNA聚合酶丧失特异性；参与转录RNA链的延伸 亚基的特性：促进RNA聚合酶与启动子紧密结合；促进RNA转录的起始和RNA链的延伸；能被重复利用；在RNA链延伸过程中，亚基不与核心酶结合 和亚基的特性：促进RNA链磷酸二酯键的形成；RNA聚合酶与启动子结合的部位 亚基的特性：与UP元件结合来增强转录4.RNA链延伸
11、所需的酶：RNA聚合酶的核心酶、拓扑异构酶5.RNA转录的终止：不依赖因子的终止：（1）需要RNA反向重复序列形成发卡结构（在U-A配对之前，使U-A配对不稳定导致RNA脱离DNA）（2）在非模板链中需要存在一串连续的T碱基，使得RNA与模板链在该段形成弱的U-A配对（因为U-A之间是两个氢键）形成发夹结构 依赖因子的终止：（1）需要因子（2）需要RNA反向重复序列形成发卡结构（3）在非模板链中不需要存在一串连续的T碱基（使RNA与DNA在该段形成弱的U-A配对） 第6讲 原核细胞中的转录调控1.乳糖操纵子（operon）机理：正调控：环境中葡萄糖耗尽通过信号转导产生cAMP（葡萄糖越多，cA
12、MP越少）cAMP与CAP（catabolite activator protein，代谢分解物激活蛋白）结合使其活化cAMP-CAP复合物与启动子结合促进RNA聚合酶与启动子的结合开启基因表达负调控：环境中存在乳糖部分乳糖转变成异乳糖异乳糖与阻遏蛋白结合抑制阻遏蛋白与操纵基因（operator）的结合开启基因表达2.色氨酸操纵子机理：环境中存在色氨酸色氨酸与辅阻遏蛋白（aporepressor）结合形成有活性的阻遏蛋白促进阻遏蛋白与操纵基因的结合关闭基因表达3.色氨酸操纵子转录的弱化作用(attenuation)：弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。前导肽基因中有两
13、个相邻的色氨酸密码子，故前导肽的翻译对tRNATrp的浓度敏感。当环境中色氨酸的浓度高时，负载有色氨酸的tRNATrp多，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度快，前导肽mRNA会形成终止构型的发夹结构，从而使转录终止，反之则不会。故而环境中色氨酸浓度低时，弱化子作用减弱，对转录的阻遏小；反之对转录的阻遏大。（详见中文教材251页“转录的弱化作用”）第7讲 真核细胞中的转录1. 真核基因的结构注：GC框的作用：转录因子的结合位点；CAAT框的作用：RNA聚合酶对启动子的识别位点；TATA框的作用：保证了转录起始位点的特异性，即有助于定位转录起始位点2.RNA聚合酶的特性特点RNA聚合酶RNA聚合酶
14、RNA聚合酶分布核仁核质核质功能合成rRNA合成hnRNA和snRNA合成tRNA和5S rRNA注：snRNA是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。3.第类启动子（非保守启动子）：核心组分包括TFIIB recognition element (BRE)、TATA框、Initiator (Inr)、Downstream promoter element (DPE)；另外，还有Upstream promoter element (UPE)，包括GC框和CAAT框。第类启动子：如rRNA基因的启动子。在物种间比较，该类启动子序列不保守，但基本结构保守；由围绕转录起始位点的核心元件和上游启动元件组成，两者的距离对转录很重要。第类启动子：存在于基因内部，如5S rRNA基因和tRNA基因注：三类启动子分
