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1、 生物技术专业大实验 课程课程编号：0741524966实 验 指 导 书主撰人 韩军丽 王雪青 金玉莲 赵培审核人 王素英天津商业大学 生物技术与食品科学学院二零零九 年 十一月2前 言1 实验总体目标 使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。 适用专业年级 生物技术专业第6学期 先修课程 生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程 实验课时分配实验项目 实验要求实验类型每组人数实验学时实验一 目的基因的PCR扩增 必做 综合 2 4实验二
2、DNA片段的回收 必做 综合 2 4实验三 DNA的连接 必做 综合 2 2实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 必做 综合 2 3实验五 重组DNA的转化 必做 综合 2 3实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒必做 综合 2 3实验七 重组质粒的酶切鉴定 必做 综合 2 4实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测必做 综合 2 12实验九 细胞凝集反应 必做 综合 2 2实验十 细胞膜的渗透性 必做 综合 2 2实验十一 细胞工程基础实验技术 必做 综合 2 4实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术必做 综合 2 4实验十三 微藻规模化培养 必做 综合 2 4 实验环境 生物技术专业实验室 实验总体要
3、求进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。 本实验的重点、难点及教学方法建议本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。3目 录实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化 实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定 实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培
4、养 4实验一 目的基因的PCR扩增一、实验目的目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。通过本实验的学习，要求学生掌握PCR 技术的基本原理；掌握用PCR 技术扩增目的基因的方法。二、实验内容设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段PCR（Polymerase Chain Reaction ）即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链
5、DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR 反应体系包括五种成分：（ 1）模板 DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA 聚合酶；（5）反应缓冲液（提供 Mg2+、pH 、离子强度） 。PCR 反应的基本步骤包括：（1）变性：高温使双链 DNA 解离形成单链（94） ；（2）退火：低温下，引物与模板DNA 互补区结合（55） ；（3）延伸：DNA 聚合
6、酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应（7072） 。PCR 反应体系的总体积一般为 25l100 l 。为了提高 PCR 的扩增效率， PCR 反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：（一）反应缓冲液：由纯水、KCl、Tris 组成。Tris 用于调节反应体系 pH 值，使 Taq 酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl 可降低退火温度，但不能超过 50 mmol/L，否则会抑制 DNA 聚合酶活性。 Mg2+终浓度为 1.52.0 mmol/L，其对应 dNTP 为 200 mol/L，注意 Mg2 与 dNTPs 之间的浓度关系，由于 dNTP 与 Taq 酶竟争 Mg2+，当 dNTP 浓
7、度达到 1 mmol/L 时会抑制 Taq 酶的活5性。Mg 2+能影响反应的特异性和产率。 （二）BSA ：一般用乙酰化的 BSA，起着减少 PCR 管对 Taq 酶的吸附作用，对 Taq 酶有保护作用。 （三）dNTPs：dNTPs 具有较强酸性，其储存液用 NaOH 调 pH 值至 7.07.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为 20200mol/L 。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq 酶：能耐 95高温而不失活，其最适 pH 值为 8.38.5，最适温度为 7580，一般用 72。能催
8、化以 DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按 53方向逐个将 dNTP分子连接到引物的 3端，合成一条与模板 DNA 互补的新的 DNA 子链。无 35 的外切酶活性，没有校正功能。用量一般为 0.55 个单位/100l。（六）模板：PCR 对模板 DNA 的纯度不要求很高，但应尽量不含有对 PCR 反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA 聚合酶抑制剂、能与 DNA 结合的蛋白质。 模板DNA 的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 （七）引物：引物浓度一般为 0.10.5 mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过
9、低。引物长度一般 1530 个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其 3末端一定要与模板 DNA 配对，末位碱基最好选用 A、C、G（因 T 错配也能引发链的延伸）。 引物 G C 约占 4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。为了提高 PCR 的扩增效率， PCR 反应温度以及温度持续时间按如下原则确定：（一）变性：模板变性完全与否是 PCR 成功的关键，一般先于 94（或 95）预变性310min，然后再进入循环程序 94变性 3060s。 （二）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度 5。引物长度在 1525bp 可通过
10、公Tm=(G C)4 (A T)2计算退火温度，一般退火温度在 4060之间，时间为 3045s。如果(G C) 低于 50%，退火温度应低于 55。较高的退火温度可提高反应的特异性。（三）延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在7075。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min 即可。 PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般2030次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预实验确定。6六、实验条件1. 生物材料和试剂质粒DNA，引物，Taq DNA聚合酶，10Taq DNA聚合酶反应缓冲液
11、，dNTPs，ddH 2O2. 仪器设备PCR仪，台式低速离心机，微量移液器， PCR管七、实验步骤1.在PCR管中依次加入反应体系各成分，混匀，然后低速短暂离心，使液体均位于PCR 管底部。（参考备注）2.在PCR仪控制面板上，设定 PCR反应的程序，然后将PCR管置于仪器中进行扩增反应。 （参考备注）3.反应结束后，取少许PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的量和特异性。备注：20 l PCR 反应体系的组成：10DNA 聚合酶反应缓冲液 2.0 l正义引物 2.0 l反义引物 2.0 l10dNTPs 2.0 l模板 DNA 50 ngDNA 聚合酶 1 UddH2O 加至总体
12、积 20 lPCR 反应参数：根据引物和模板DNA的特点以及扩增片段的长度而定，一般参数为：94C 5 min；94C 50 s，56C 1 min，72C 1 min/2 min，30个循环；72C 10 min。八、思考题本实验中10Taq DNA聚合酶反应缓冲液的成分及各成分的浓度是什么？为什么这样配制？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出扩增产物电泳结
13、果示意图） ；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基7础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用微量移液器、台式离心机等。注意电源安全。PCR 仪的使用必须在老师的指导下进行。实验二 DNA片段的回收一、实验目的DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术。通过本实验的学习，要求学生掌握常用的从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原理和方法。二、实验内容用离液序列高的盐溶解琼脂糖凝胶，结合硅质吸附柱回收琼脂糖凝胶中的DNA。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告
14、。五、实验原理、方法和手段DNA 片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于克隆或是制备探针、回收 PCR 产物用于再次鉴定等。迫于基因工程操作的需要，自 70 年代初期就已开始 DNA 片段分离与回收的研究，到 70 年代中期己探索出了 2 至 3 种较为有效的方法。理想的 DNA 片段回收方法应满足以下几个要求。首先，回收片段应有非常高的纯度，如从普通琼脂糖中分离出的片段不可带有即使是微量的凝胶因为它会抑制绝大部分的酶活力；回收过程中加入的各种物质最后也要彻底除干净，因为酶是极其敏感的生物催化剂，杂质可能导致酶的异常反应或是抑制酶的全部活力。其次，回收过程必须
15、是严格的无 DNA 酶污染的操作过程，不然会发生回收片段降解的现象，有时其至当降解仅仅发生在粘性末端时也会导致连接反应的失败。再者，要求回收技术能用于不同大小的 DNA 片段，如回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用。第四，要求回收方法有较高的效率，能进行微量 DNA 操作。最后，要求操作方便、快速，不需要昂贵的试剂与特殊的器材。DNA 片段回收方法包括电泳回收法、收集孔电泳回收法、机械破碎凝胶回收法、溶（熔）胶回收法、琼脂糖酶降解凝胶回收法等五8大类方法。溶（熔）胶回收法是常用的方法之一，包括低融点胶法、碘化钠法、碘化钾密度梯度离心法和 NaClO4玻璃纤维纸吸附法。碘化钠法的原理是琼脂糖能溶解于离液序列高的盐(也称促溶剂) 中，常用的盐有NaI
