生物化学实验报告

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1、实验一 考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白质的含量（p24）一、目的要求 掌握考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质含量原理和方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰 G-250 染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由 465nm 变为595nm。且在蛋白质一

2、定浓度范围内符合比尔定律， 通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且

3、在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+ 、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 三、材料、试剂与器具 （一）

4、 、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入 100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至 1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G250,4.7%（W/V）乙醇， 8.5%（W/V）H 3PO4。2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。（二）标准和待测蛋白质溶液 1标准蛋白质溶液 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/m

5、l 蛋白溶液。2待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用 0.15mol/L NaCl 稀释 200 倍。 （二） 、器材：1、试管 1.515cm（6）和试管架。2、移液管管 0.5mL（2）； 1mL（2）；5mL （1）；3、可见光分光光度计。 （三） 、标准曲线制作：2、以 A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（ ） ，在坐标轴上绘制标准曲线。1）利用标准曲线查出回归方程。2）用公式计算回归方程。一般相关系数应过 0.999 以上，至少 2 个 9 以上。4） 、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。（四） 、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在

6、所测范围内） ，依照操作步骤 1 操作，测出样品的 A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的 A595nm 值在 0.10. 5 之间，所以上述样品如果 A595nm 值太大，可以稀释后再测 A595nm 值，然后再计算。（五） 、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。5、在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 6、测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 实验二、紫外吸收法测定核酸的含量

7、一、 目的1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、 原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（CC 一 CC 一），能够强烈吸收 250280nm 波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在 260nm 处。遵照 Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。试管编号 0 1 2 3 4 5 未知200ug/ml 标准蛋白（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.15mol/L NaCl （ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0考马

8、斯亮蓝试剂 （ml） 6 6 6 6 6 6摇匀，1h 内以 1 号管为空白对照,在 595nm 处比色蛋白质浓度（ug/ml） 0 5 10 15 20 25A595nm在不同 pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的 pH 溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以 （）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在 260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的 pH 和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH =

9、7.0）如下：DNA 的 （）= 6 000 8 000RNA 的 （）= 7 000 10 000 小牛胸腺 DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）的 （）= 6 600，DNA 的含磷量为9.2%，含 1g/mL DNA 钠盐的溶液光密度为 0.020。RNA 溶液（pH = 7.0）的（）= 7 7007 800，RNA 的含磷量为 9.5%，含 1g /mL RNA 溶液的光密度为 0.0220.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，浓度为 1g/mL 的 DNA 溶液其光密度为 0.020，而浓度为1g/mL 的 RNA 溶液其光密度为 0.024。

10、因此，测定未知浓度的 DNA（RNA）溶液的光密度 OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸 3gmL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约 40，这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和 -键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromic effect）。蛋白质和核苷酸也能吸收

11、紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处，在 260nm 处的吸收值仅为核酸的 110 或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值.在 2.0 以上；DNA的 260nm 与 280nm 吸收的比值则在 1.9 左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。三、实验材料、主要仪器和试剂（一）试剂1标准核酸溶液（酵母 RNA 或小牛胸腺 DNA，用 0.01NaOH 溶液配制成500g/ml 溶液）2待测核酸样品（二）器具1、紫外分光光度计2、微量注射器（5

12、0L）3、移液管3试剂（1）5%6%氨水：用 25%30氨水稀释 5 倍。（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取 3.6mL70%过氯酸和 0.25g 钼酸铵溶于 96.4mL蒸馏水中。四、操作步骤（一）核酸紫外吸收光谱的测定取 100L 的 RNA 溶液于试管中，加入 5 mL 蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液在 220290nm 波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值（即 A 值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。（二）核酸溶液含量的测定将上述测吸收光谱溶液的 A260 直接计算溶液的 RNA 含量五、注意事项如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸

13、，则在测定时需加钼酸铵过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液 A 值作为对照。六、思考题1采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？2若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？参考答案1用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。2当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液 260 nm 处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液 260

14、nm 光密度中扣除。实验三 植物体内过氧化氢酶活性的测定一、目的过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。二、原理过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量来表示，当酶与底物（H 2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的 H2O2 量。以钼酸铵作催化剂，使 H2O2 与 KI 反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应式为：H2O2 + 2KI + H2SO4 I 2 + K2SO4 + 2H2OI2 + 2Na2S2O3 2NaI +

15、 Na2S4O6根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解 H2O2 的量。A260三、 材料、仪器设备及试剂1. 材料：水稻叶、甘蔗叶及其他植物叶片。2. 仪器设备：分析天平；恒温水浴；研钵；100ml 容量瓶；100ml 三角瓶；滴定管；滴定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。3. 试剂及配制1.8molL1 H2SO410(NH 4.)6MO7O40.02 molL1 Na2S2O320KI1淀粉液CaCO3 粉石英砂0.018H 2O2 溶液配制：吸取 30H 2O2 原液 0.3ml 至 50ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后再稀释 10 倍。四、实验步

16、骤1. 过氧化氢酶的提取选取甘蔗功能叶片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取 1g 放入经冷冻过的研钵中，加少量 CaCO3 粉末及石英砂，并加入 34ml 蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液10ml 至 100ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。2. 酶活性测定2.1 取 100ml 容量瓶 4 个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液 10ml，立即向 3、4 号瓶中加入 1.8molL1 H2SO4 5ml 以终止酶活性，作为空白测定。2.2 将各瓶放在 20水浴中保温 510min（若室温超过 20则以室温为准） 。保温后向各瓶准确加入 0.018H 2O2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。2.3 将各瓶放在 20水浴中让酶与底物（H 2O2）作用 5min。