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1、实 验 四 圆盘电泳分离人血浆蛋白质 紫外吸收法测定蛋白质的含量,一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 （圆盘电泳）,玻璃管,分离胶,浓缩胶,(-),(+), 主要过程 ,凝胶柱的制备 加 样 电 泳 剥 胶 固定和染色 漂洗,(-),(+),1凝胶玻璃管的准备（封口） 2分离胶的制备 3浓缩胶的制备 4. 玻璃管安装,凝胶柱的制备与安装,封口胶,封口防漏 配液防凝 操作防毒 滴管灌胶,6%分离胶的制备（每组四人）,A液 1ml C液 2ml H液 2ml G液 5ml 正丁醇 封顶 等待聚合（约30分钟）,混匀后分装4管,3%浓缩胶的制备（每组四人）,B液 1ml D液 2ml E液 1ml F液
2、 4ml 正丁醇 等待封顶聚合（约10分钟）,混匀后分装4管,注意事项：,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（C、D）是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。用完加盖。 TEMED（A、B）要密封保存，用完加盖。 过硫酸铵（G）溶液最好新鲜配制，以防止氧化失效。用完加盖。 核黄素（E）需避光保存。,玻璃管安装,（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）,加 样,电 泳,(-),(+),电泳（浓缩胶时3mA/ 管，分离胶时2mA/ 管，距底1cm时止）,剥 胶 固定和染色 漂洗,固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮,实验分组（每人做
3、一管，每4人配一份胶） 认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用） 封管 分离胶配制与灌胶 （浓度为6%，每组总体积为10ml，灌胶高度为78cm） 封正丁醇 （手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）,浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样） 倒掉正丁醇 灌浓缩胶 封正丁醇（观察界面，判断凝固时间） 安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）,样品处理并加样（20ul） 加buffer 电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，距底1cm时停止） 剥 胶,固定（时间5min）,染色（时间2min）,漂洗脱色至背
4、景透亮,（一） 电泳的基本原理及相关知识, 电泳的概念,带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定, 电泳的基本原理,主要利用分子之间的两个方面的差异来分离：,分子所带电荷 电荷性质（+/-） 电荷数量,分子形态 分子量大小 分子的三维构象形状, 电泳分离蛋白质的原理, 蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质 电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状 的差异, 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）, 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低
5、时，聚合速度减慢。, 电泳的影响因素, 带电粒子的性质 电场强度 溶液的pH, 溶液的离子强度 电渗现象 环境因素,（二）、聚丙烯酰胺凝胶电泳, 聚丙烯酰胺凝胶, 两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。, 合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法, 化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED） 光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED）, 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理,Gly -,Pro -,Cl-,Gly -,Pro -,Cl-,Cl-,Cl-,Cl-,Pro -
6、,Pro -,Pro -,Gly -,Gly -,Gly -,pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly）,pH为6.7的浓缩胶,pH为8.9的分离胶,有效泳动率： MCl- M Pro- M Gly-,Gly -,Gly -,Gly -,Cl-,Cl-,Cl-,Pro -,Pro -,Pro -,快离子Cl 慢离子Gly Gly pK1=3.24 pI6.0 pK2=9.7,浓缩效应,浓缩效应可显著提高电泳的分辨率 由较低浓度的丙烯酰胺构成; 浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶; 当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积
7、”在浓缩胶和分离胶之间.,浓缩胶还具有比分离胶更低的pH 浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,该pH远低于Tris的pK值(8.1)。 分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl， 电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。 在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。 当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度
8、增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。,分离主要依据,蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。 蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。,（三
9、）、实验结果的分析, 相关理论,表-1 血清中各蛋白质的相关特性,种 类,分子量（万）,PI,分 布(%),清蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,6.9,5.0,9.0,13.0,11.0,6.1,7.3,6.8,7.6,8.0,55,2.130.8,4.172.5,1.225,15.6,前清蛋白,清蛋白,2-球蛋白 1-球蛋白,-球蛋白,-球蛋白,紫外吸收测定蛋白质含量,利用经验公式直接计算样本蛋白质含量 （P130）,器材 UV-752型紫外分光光度计 试剂 (一) 蒸馏水 (二) 清蛋白(人或牛)纯晶 (三) 待测样本蛋白质,操作步骤,用水稀释蛋白质样本，稀释1-3倍，在2
10、80nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。 1、OD2800D2601.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mgm1) 1.5OD2800.75OD260 2、OD280OD2601.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mgm1) = OD280（KL）（OD2806.31）10gL 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm6.3（100mlcm.g） K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数； L：溶液厚度,标准曲线,【方法评价】,操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。 但核酸含量小于20或溶液混浊、则测定结果误差较大。 公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故计算结果有一定误差。如果设定标准管，则应与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。,
