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1、,生物选修3,1.2基因工程的基本操作程序,专题1 基因工程,目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序的步骤：,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,阅读与思考,1、什么是目的基因？ 2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？,一、目的基因的获取,1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。 2、目的基因获取方法： 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法直接人工合成,从基因文库中获取目的基因,基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的
2、不同基因，称为基因文库。,基因文库,基因组文库,部分基因文库 （如cDNA文库）,基因文库的构建过程,基因组文库,基因文库的构建过程,mRNA,单链DNA,双链DNA,cDNA文库,如何从基因文库中找到所需要的基因？,依据目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。,从基因文库中获取目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,PCR的全称： 聚合酶链式反应 PCR的原理： DNA复制 PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。,模板 原料 引物 酶 控制温度,利用PCR技术扩增目的基因,目的基因
3、DNA,四种脱氧核苷酸,如单链DNA分子片段,耐热的DNA聚合酶,PCR仪自动调控,PCR的条件：,PCR的过程：,利用PCR技术扩增目的基因,变性(90-95),复性(55-60) (退火）,延伸(70-75),用化学方法直接人工合成,条件：,基因较小，核苷酸序列已知。,二、基因表达载体的构建核心,用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒,二、基因表达载体的构建核心,二、基因表达载体的构建核心,目的基因,二、基因表达载体的构建核心,1、基因表达载体的组成,目的基因 启动子: 终止子: 标记基因、复制原点等,一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的首端。,一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的
4、尾端。,启动子的作用：,二、基因表达载体的构建核心,终止子作用：,使转录在所需要的地方停止。,标记基因作用： 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。,是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,二、基因表达载体的构建核心,2、基因表达载体的构建目的：,a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 b.使目的基因能够表达和发挥作用。,三、目的基因导入受体细胞,1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎
5、样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,三、目的基因导入受体细胞,1.目的基因导入植物细胞,常用的方法: 农杆菌转化法、基因枪法、花粉 管通道法,农杆菌的特点: a.易感染双子叶植物和祼子植物。 b.具有趋化性。 c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,三、目的基因导入受体细胞,三、目的基因导入受体细胞,1.目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法的导入过程:,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,.目的基因导入动物细胞,常用的方法: 显微
6、注射技术 操作程序：,三、目的基因导入受体细胞,a.先提纯含目的基因的表达载体 b.从动物体内取出卵(受精卵） c.显微注射仪进行显微注射 d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体,3.目的基因导入微生物细胞,原核生物的特点: 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。,大肠杆菌的转化过程:,用Ca2+处理细胞,增加细胞壁的透性，与细胞膜无关,三、目的基因导入受体细胞, 感受态细胞,重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理
7、来检测目的基因和相应的mRNA？ 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？,1.目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上,目的基因的检测内容和方法,检测方法:,DNA分子杂交技术,DNA探针：,用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。,四、目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交技术,基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。,2.目的基因是否转录出mRNA,目的基因的检测内容和方法,检测方法:,分子杂交技术,用DNA探针与mRNA杂交。,四、目的基因的检测与鉴
8、定,目的基因的检测内容和方法,检测方法:,抗原抗体杂交,3.目的基因是否翻译出蛋白质,四、目的基因的检测与鉴定,4、个体生物学水平的鉴定 如抗虫、抗病的接种实验,四、目的基因的检测与鉴定,4、珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的珠蛋白，想一想，应该如何设计？,思考与探究,思考与探究,1.从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列（CDNA）。 2.将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出了大肠杆菌菌落，则表明珠蛋白基因已进入。 4.培养进入了珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取珠蛋白。,
