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1、分子肿瘤概论,重庆医科大学病理教研室 王娅兰 教授(博士生导师),一、有关肿瘤的基本概念（复习） 肿瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 调控失常 异常增生 新生物 肿瘤生物学行为-浸润、转移能力 浸润 (invasion)：起源处迁移 侵入周围邻近组织,转移(metastasis)： 从原发部位 血管、淋巴管、体腔 它处继续生长 与原发瘤同样类型肿瘤 （转移瘤或继发瘤）,转移的途径,浸润生长是恶性肿瘤生长的特点， 也是肿瘤转移过程必经的第一步。,肿瘤的组织结构 实质 （parenchyma) 间质 （mesenchyma, stroma) 肿瘤间质的主要成分 1 血管 毛细血管，小
2、动、静脉 血窦样血管 血管球样增生 血管内皮增生肿胀,新的肿瘤血供模式 -血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM) 1999年，美国学者Maniotis等 一种完全不同于经典血管生成的微循环模式 -管壁主要由基底膜(PAS阳性)围成，外衬以肿瘤细胞 -腔内有血浆和红细胞流动, 管道与内皮性血管相 多存在于高度恶性肿瘤,2 结缔组织间质 （1）纤维和基质 胶原纤维 常规 HE - 红 特殊化学染色 VG 改良法- 红 Masson- 兰色,构成成分 I II III型胶原原纤维 又由相应原纤维分子构成 免疫组化或分子生物学方法可区别,弹力纤维 常规 HE-淡红色 特殊化学染
3、色 Weigert或Verhceff-暗兰或黑色，弹力酶消化后阴性,网状纤维 银染-黑色，故也称嗜银纤维。 PAS -强阳性 成分 胶原蛋白为主要成分 细胞间质网状纤维 - 型胶原蛋白 基底膜网状纤维 - 型胶原蛋白 -层黏连蛋白（laminin）,纤维黏连蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 连接基质中各种成分 B. 介导细胞外基质成分与细胞表面连接 黏蛋白 又称蛋白多糖（proteoglycan） 如透明质酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin）,（2）基底膜 (basement membrane , BM) 多种成分 与肿瘤浸润关系密切 型胶原 层黏连蛋白 （lam
4、inin ,LM）,（3）细胞成分 固有的细胞成分 -成纤维细胞和纤维细胞 -肌成纤维细胞 -间充质细胞 -巨噬细胞 -树突状细胞,反应性细胞成分 各种细胞浸润 - 淋巴细胞 最常见 -浆细胞 -巨噬细胞 都属免疫活性细胞,二、肿瘤浸润、转移的分子机制 （一）肿瘤细胞的浸润转移 1.肿瘤细胞增殖和扩展 浸润转移的前提和基础 2.肿瘤血管生成(tumor angiogenesis) 肿瘤浸润转移的必要条件,3.肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附 （1）瘤细胞表面负电荷增加 （2）瘤细胞黏附力的改变 瘤细胞自身结构异常 瘤细胞同质黏附力下降 指同种瘤细胞之间的黏附力,瘤细胞异质黏附力增加 指肿瘤细
5、胞与其它不同细胞及间质的黏附力 细胞表面的黏附分子介导 通过配-受体之间的识别和结合实现,（3）肿瘤黏附因子(adhesion molecules) 细胞表面结构 钙黏蛋白(cadherin) 又称为钙连接素，钙黏素 据分布不同 E-钙黏蛋白 P-钙黏蛋白 N-钙黏蛋白 H-cad,整合素(integrin) -细胞表面糖蛋白 ，约有20 多个亚型 -各种肿瘤细胞表面整合素种类不同 -肿瘤生长各个阶段表达水平也不同,作用 a.介导细胞与细胞外基质的黏附 b.参与不同细胞之间的黏附连接 C.扮演细胞信号传递的角色, 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主
6、要参与细胞与细胞间的连接 ICAM-1 （细胞间黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神经细胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC,选择素(selectin) 内源性植物凝血素（凝集素） 作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附 选择素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin, CD44 及其它 CD 44(透明质酸受体) 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） 跨膜超级家族基因蛋白（TM4ST）,4.瘤细胞的迁移(migration)及化学趋向性 (1)瘤细胞的运动 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝 (2)瘤细胞运动的调节 据其作用
7、，大致可分为两大类： 既影响运动又影响生长的因子 仅影响运动的因子,肿瘤细胞运动和增殖 AMF (自分泌运动因子) 1986年Liotta 等首先发现并命名 它源于肿瘤细胞本身且作用于肿瘤细胞. HGF/SF（肝细胞生长因子/分散因子) 生物学作用存在多态性 HGF 和AMF是近期发现的最强大的动力因子,(3)瘤细胞的化学趋向性 21KD 的蛋白质 骨吸收因子,5.细胞外基质的降解 (1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他间质成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤细胞 邻近的细胞外基质 第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内,(2)肿瘤细胞产生的
8、蛋白水解酶 丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子 纤溶酶 (纤维蛋白溶解酶) 纤溶酶原 a. 降解基质 b. 激活胶原酶 胶原降解,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系统 Au-PA： 介导细胞周围基质蛋白的降解 Bu-PA 受体（u-PAR）及纤溶酶原受体 活化u-PA 原酶形式的u-PA 纤溶酶原+纤溶酶原受体 纤溶酶,uPA与u-PAR还能激活信号传导系统， CPAI （PA 抑制剂） PAI1 是u-PA 的主要抑制剂 PAI2 不同肿瘤表达意义不一 PAI3 功能不清,基质金属蛋白酶（matrix metallopr
9、oteinases, MMP） 需钙、锌离子作辅助因子 MMP 分类 胶原酶：如间质胶原酶 （Collagenase） 明胶酶：如明胶酶A (gelatinase A) 间质溶素：如间质溶素1 、2 膜型基质金属蛋白酶：、型,可分别降解ECM中各种不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶类 金属蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-2 浸润与否取决于MMP与TIMP的对比,胱氨酸蛋白酶类 Cathepsin B 作用 降解ECM中各种胶原、LM、 FN、黏蛋白 激活间质胶原酶和IV型胶原酶,天（门）冬氨酸蛋白酶 包括组织蛋白酶D,E ( cathepsin D, E ) CD ： 在肿瘤浸润转移
10、中的作用 CD 表达的调节 不同组织调节因素不完全一致 CE 在肿瘤,6.瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子 微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙 瘤细胞存在形式 单个 成团 同类癌栓 异类癌栓 黏附分子对其发挥调节作用,7.在特定器官的毛细血管滞留并黏着，再次穿过血管壁并定居、增殖 器关特异性（选择性）机制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化学趋化因子 (3) 微环境不适合 (4) 与免疫状态有关,（二）机体免疫状态与肿瘤浸润转移 参与控制转移的免疫细胞主要有 NK 细胞 巨噬细胞 T 淋巴细胞 （三）肿瘤浸润转移相关基因 转移相关基因,（四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移 表观遗传学(Epige
11、netics) -与遗传学(genetic)相对应的概念 -表型状态改变，基因型不改变 -没有DNA序列变化的情况下， 可遗传的基因表达改变，导致的基因产物的变化。 DNA的“后天性”修饰（如甲基化修饰）、组蛋白的各种修饰等,（五）肿瘤干细胞(tumor stem cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006年美国癌症研究协会（AACR）定义 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞,特征 (1) 无限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信号传导途径 (3)具不同表型，异质性，对放化疗不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能转移到各种不同的组织,（六
12、）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 肿瘤细胞 间质细胞 细胞外基质 间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子） 共同构成的局部内环境,微环境改变 肿瘤细胞 -自分泌和旁分泌 全身和局部组织 -代谢、分泌、免疫 结果： 限制或促进肿瘤的发生和发展,三.肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 (一)基因扩增的检测 1.过量的蛋白表达 -免疫组化（荧光）定位 -ELISA和Western blot 定量,抗原,抗体,标记,标记,抗原,标记,标记,抗原,标记,2.基因拷贝数的增加、转录产物mRNA的增加 - 核酸分子生物学方法进行检测 核酸变性、复性基本性质 常用方法,(1)核酸分子杂交（nucleic ac
13、id molecular hybridisation）技术 最常用的基本技术 基本原理： -标记的已知碱基序列 （DNA或RNA单链片段） （探针probe ） （同位素 P32 I125 非同位素 生物素 地高辛 荧光素） -检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之 同源的序列,1.原位杂交 （ISH） 2.荧光原位杂交 （FISH）， 3.双色（多色）银染原位杂交（DSISH） 3.Southern blot (DNA 杂交) 4.Northern blot (RNA 杂交),（2）聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR）技术 又称体外基因扩增 利用DNA
14、变性和复性原理 体外进行 特定的DNA 片段高效扩增 获得或放大特异基因信号的重要手段,扩增产物的检测 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带,Real-time PCR 原位PCR RT-PCR 3.基因芯片技术,(二)基因突变的检测方法 1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 长度相同，但碱基序列不同的单链DNA 构象不同 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳 迁移率（泳动
15、率）不同,基本方法 作PCR 将产物变性而成为单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果 可用同位素/荧光素标记 非同位素标记,2.PCR-限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技术 基本原理 -序列中一个碱基发生改变 -使原来的内切酶位点消失 或产生新的酶切位点 -用限制性内切酶消化PCR 扩增出来的DNA片段 -检测其酶切片段长度的差异,3.变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 基本原理 电泳时，不同浓度凝胶温度不同 DNA链中有一个碱基改变 在不同的温度发生解链 电泳迁移率改变,4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 荧光原位杂交 ( FISH) 6 DNA 芯片技术（DNA chip ）,（三）肿瘤的微卫星不稳定性分析 微卫星不稳定性（microsatellite instability , MI）, 是指简单重复序列的增加或丢失 检测方法 PCR + DNA 序列凝胶电泳,（四）肿瘤易感性检测 遗传癌症综合征与易感性 癌症综合征 易感基因 视网膜母细胞瘤
