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1、DNA Extraction DNA提取,中山医学院法医物证教研室 吕德坚,DNA提取的原因,DNA的分型需要DNA的直接参与反应过程 DNA位于细胞内，细胞内可能含有抑制反应的蛋白或其他细胞成份 DNA和蛋白质结合在一起 不同的反应需要应用不同的DNA 没有杂质纯DNA可使反应达到最佳 法医学生物检材常含有抑制酶、PCR反应的物质,DNA提取方法,不同的检材用不同的方法 不同的检材量可能使用不同方法 和检材的细胞类型有关 可根据肉眼、检查、显微镜下以及预试验来决定DNA的提取方法 DNA提取的主要方法 有机法（酚/氯仿法） Chelex法 FTA纸法 硅珠法、磁珠法 碱裂解法,DNA EXT
2、RACTION,ORGANIC CHELEX FTA PAPER OTHERS NON-ORGANIC (6M NaCl) QUICK & DIRTY (0.2M NaOH) QIAamp,DNA提取的基本一般过程,破膜：裂解细胞膜、核膜 去圬剂：SDS，低渗 破坏蛋白质 PK、加热 提纯DNA 沉淀 去除杂质 吸附杂质,有机法(organic extraction),经典的DNA抽提法 先用SDS破膜，PK消化蛋白质，释放DNA 用酚一氯仿萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中 再用无水乙醇脱水，使DNA沉淀出来 其提取的DNA分子结构完整，纯度较高，可抽提样本量大的D
3、NA 酚/氯仿法几乎适用所有种类生物检材的DNA提取，是DNA提取的基本方法。,全血有机法过程,溶血：抗凝全血+红细胞裂解液； 离心，吸去上清，保留离心管的底部有白色白细胞沉淀。 沉淀物中加入细胞核裂解液(10mmol/L Tris-HCl pH8.2, 0.4mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA)，混匀 加入SDS+蛋白酶K，摇匀。37孵育消化8小时以上。 酚/氯仿法提取 加入与溶液等体积的Tris-HCl饱和酚，轻摇，使酚和溶液混匀。摇晃太大力，可使DNA断裂。要有耐心。,离心。离心管内的溶液分成两层，上层为含DNA的水相，下层为含有蛋白质的酚。将上层液体用吸管转移至另一个离心
4、管内。注意不要触动分界面上积聚的变性蛋白。 加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合物(酚:氯仿:异丙醇=25:24:1），混匀溶液，离心，离心管内的溶液分成两层，上层为含DNA的水相。将上层液体用吸管转移至另一个离心管内。 加入等体积的氯仿/异丙醇混合物(氯仿:异丙醇=24:1），混匀溶液，将上层液体用吸管转移至另一个离心管内。 加入23倍体积的冷100乙醇（-20），轻轻来回倒置摇匀，即见白色絮状的DNA析出。,DNA可用火焰灭菌的玻璃钩针钩出，70冷乙醇淋洗二次，室温干燥。干燥DNA的插入装有1TE的Eppendorf管中，使DNA逐渐溶解从钩针上溶解下来。 或者高速离心，使DNA沉淀下来，去掉
5、液体。再用70冷乙醇洗2次，以去除盐离子。室温干燥后，加入适量的1TE或水溶解DNA。溶解DNA时最好是要过夜，因为过于干燥的DNA较难溶。 提取的DNA在-20可保存数年。,酚/氯仿法中各种试剂主要作用,蛋白质分子表面带有亲水性基团，易通过水合作用进入水溶液中。酚的极性较低，氯仿是非极性分子，水是极性分子。酚或氯仿可以挤走蛋白质水溶液中的水分子，蛋白质失去水合作用而变性沉淀出来。酚或氯仿与水溶液的混合物离心后，由于比重的不同，酚/氯仿位于试管下层(有机相)，水相位于上层。变性的蛋白质则聚集在两者的界面。DNA具有亲水性，仍保留在水相中。,酚的变性作用很强，但与水有一定的互溶，这部水溶液中的D
6、NA就会丢失。氯仿的变性作用不如酚，但与水不互溶，不会带走DNA。所以抽提过程中酚与氯仿混合使用。氯仿还有助于水相与有机相分离。 氯仿与酚是互溶的，酚/氯抽提后，单独用氯仿再抽取一次，以去除残留的酚。否则酚对后面的反应有抑制作用。 酚是酸性的，DNA可溶于酸性有机溶剂，因此，酚在使用前必须用0.5M Tris-HCl(pH8.0)饱和，使其pH值在7.8以上。酚的饱和过程又叫做酚的平衡，经过饱和pH值在7.8以上的酚称为饱和酚或平衡酚。pH8时，DNA更易进入水相中，并防止酸性酚溶解DNA。,经饱和的酚常加入0.01% (w/v)8-羟基喹啉固体粉末（8-hydroxyquinoline)，此
7、时的饱和酚为淡黄色。这种酚可以在4保存一段时间。之后淡黄色消失或呈粉红色，说明酚已被氧化，不能再使用。8-羟基喹啉不仅具有抗氧化作用，而且是一种指示剂。8-羟基喹啉还是弱的金属离子螯合剂，有抑制RNase的作用。 异戊醇的作用是降低分子的表面张力，减少混合过程中泡沫的发生，使有机相和水相充分作用。并使有机相、变性蛋白和水相易于分相。,SDS的作用,SDS是一种去垢剂，它可以破坏细胞膜，解聚核蛋白，使蛋白质变性。,EDTA（ethylenediaminetetra-acetic acid，乙二胺四乙酸)的作用,EDTA常用它的钠盐。TE等缓冲液中含有EDTA，EDTA是一种螯合剂，可以螯合Ca2
8、+、Mg2+等离子，这些离子是核酸酶具有活性所必须的辅基。因此，EDTA可以抑制核酸酶对DNA的降解。,乙醇的作用,乙醇主要用来沉淀DNA。乙醇可以与水相溶，通过脱水作用夺去DNA周围的水分子，使DNA分子发生聚合而沉淀出来。使用时一般加入DNA溶液2倍体积的无水乙醇，使其终浓度为67%左右。 乙醇在使用前一般使用要在-20中预冷，其目前是降低分子的运动，使DNA易于沉淀出来。 沉淀出来的DNA要用70%的乙醇洗涤，其目的是洗去一些离子，以防止这些离子对以后实验的影响。,蛋白酶K,蛋白酶K(proteinase K，PK)的主要作用是降解蛋白质。PK的使用终浓度一般为100g20mg/ml。,
9、酚/氯仿的缺点,1有的生物学检材，包括血、软组织、精液、唾液、牙齿和骨等，以及各种附在物体上（如布类、地毯、墙壁、木材、信封和烟蒂等）的斑痕，在提取之前，这些检材已经受到各种环境因素的作用，如温度和湿度的变化、微生物和化学物质的污染、士壤及其他自然界物质接触（如盐、水）；提取后的保存不当也会引起DNA的降解。这些常含有抑制PCR的物质。有机法在提取这些检材的DNA时常出现不能去除抑制物的情况，尽管可以提取到足够多的DNA，但扩增并不总是成功。,2为了去除有抑制物，用有机溶剂抽提之后，要用Centricon 100或Microcon 100进行透析和浓缩，因此有机法的DNA提取过程比较复杂，也比
10、较耗时。 3步骤多，样本需要多次转移增加了污染的可能性。 4损失部分DNA。 5酚和氯仿等有机溶剂对人体有害。,ORGANIC DNA EXTRACTION,PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) RFLP or PCR YIELDS HIGH MOLECULAR WEIGHT DNA (HMW DNA) TIME CONSUMING HAZARDOUS CHEMICALS MULTIPLE TRANSFERS (possible errors),盐析法,往DNA溶液中加入NaAc或NaCl，使溶液中的离子发生，DNA所带的电荷随之发生改变，DN
11、A析出。离心可使之沉淀出来。,Chelex法,Chelex是一种螯合离子交换树脂，1991年Walsh等人用Chelex 100处理法医学检材，发现用它提取DNA非常适合于用PCR的扩增，从此成为法医学上最常用的DNA提取方法。 Chelex 100这种树脂由苯乙烯、二乙烯基苯共聚物组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，是多价金属离子的螯合基团。Chelex可以螯合铜、铁及其他重金属离子包括钠、钾等单价阳离子，对二个离子的亲和力特别强。,CHELEX EXTRACTION,1991 Bio-Rad Laboratories CHELATING RESIN REMOVES MAGNESIUM (I
12、NACTIVATES DNA NUCLEASES) USE WITH PCR ONLY,金属离子是PCR反应的抑制剂，Chelex 100通过螯合金属离子清除PCR反应的抑制剂，起纯化的作用。Chelex 100不会改变非金属离子的浓度。 核酸酶具有活性必须有金属离子。在高温和低离子强度的条件下，金属离子是DNA断裂的催化剂。Chelex 100通过螯合金属离子保护DNA，阻止DNA的降解。 Chelex 100具有碱性，在100条件下，细胞膜被破坏，DNA发生变性而释放出来。Chelex 100本身并没有提取DNA的能力。 除了金属离子以外，Chelex 100可能还结合了其他一些PCR抑制
13、剂，如亚铁血红素或其衍生物。,全血的Chelex100提取法（Chelex100 Extraction of Whole Blood）,分离出白细胞。 加入用无菌去离子H2O水制备的5%(w/v)的Chelex-100 悬液200l，振荡，重悬沉淀。 在56温育30min后，高速振荡510 s。 水浴中煮8 min，或在PCR仪中99 10min。 高速振荡5 s，10000rpm离心10min，使树脂、细胞碎片和变性的蛋白质沉淀。 取上清进行DNA定量和PCR扩增。,Chelex 100法优点,1步骤少，简单，快速，省时。 2提取过程在一个管内完成，避免污染，减少操作上所致的失误。 3清除P
14、CR抑制物，提高PCR的成功率。 4所需的检材量少。 5避免了如酚/氯仿等化学试剂所潜在的危险性。,Chelex-100法的缺点,1处理的检材量不能太多，只适用于提取少量的DNA。 2提取的DNA的纯度不及有机法。 3提取的是单链DNA，不能用来做RFLP分析。,Chelex-100法的注意事项,1Chelex 100树脂颗粒会沉淀，使用前必须摇匀悬液。 2吸取Chelex 100悬液的吸头的孔径要比较大，必要时可剪去一部分，以保证吸到的是5%悬液。 3Chelex 100法的第一步首先要洗去可能有的污染物和抑制物，如亚铁血红素和其他蛋白，必要时可洗几次。组织和骨头则不需要洗涤这一步。,4Ch
15、elex 100法不含有纯化的步骤，如果检材含有抑制物和污染物，增加检材的用量也会同时提高抑制物和污染物的浓度。要确定是否有扩增抑制物，可以取部分检材的提取液加入已知阳性对照的反应中，观察扩增是否受到抑制。 5如果血痕紧紧地吸附在基质上，第一步洗涤的时候应放在56中，以助于血从基质上溶解下来。 6每批新的Chelex 100都要进行测试。可用已知基因型的血痕或全血提取DNA，或者先用少量Chelex 100悬液中加入1/10（w/v)的已知DNA，然用最灵敏的方法进行PCR扩增和分型。如果有扩增产物，分型结果理想，说明该Chelex 100没有抑制物。,75% Chelex 100悬液都应新鲜
16、配制。Chelex 100在水中几个小时后的螯合能力就会逐渐下降。 8Chelex 100发挥作用应要有一定的pH值，5% Chelex 100悬液的pH值应为10.0和11.0之间，若不在这个范围内也不要调整悬液的pH值。 9Chelex 100提取所得的是单链DNA，不适宜用插入染色剂（如溴乙锭）的方法来定量。建议用缝隙印迹（slot-blot）杂交法定量,10Chelex 100提取液如果短时间内（1个月）保存，可贮存在4；若要长期保存，离心后弃去Chelex 100树脂，取上清液冻存于-20。Chelex 100树脂在过了一段时间后会变质降解，原来结合在树脂上的抑制物就会释放出来，树脂本身也会螯合镁离子而抑制PCR。 11由于Chelex 100能螯合镁离子，所以PCR反应体系中不能有Chelex 100树脂，必须充分离心去除。,FTA paper method,将血液滴于FTA卡上，或将口腔拭子涂于FTA卡上，晾干。 用打孔器取一小块有标本的FTA卡放一PCR管中。
